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1.07. Photometrie - Quantitative Bestimmung von Eiweiß

1 Hühnerei

1 Glas Wasser
Pasteurpipetten mit Hütchen
Filtrierpapier
Kleenextücher
Reagenzgläser im Gestell
Parafilm
50 ml Meßzylinder
5 ml Pipetten
1 ml Pipetten
2 n NaOH
Biuretreagenz : (in 400 ml einer carbonatfreien 0,2 n NaOH werden 9 g K - Na - Tartrat und danach 3 g CuSO₄ gelöst. Dann setzt man 5 g KJ zu und füllt mi 0,2 n NaOH auf 1 Liter auf. - Die Lösung wird in einer braunen Flasche aufgehoben).
Eialbuminlösung: 20 mg/ml

Spektralphotometer ED 1204, eingestellt auf lambda = 550 nm
Küvetten (hier 3 kleine Reagenzgläser)
Wasserbäder, eingestellt auf 95°C

Farbige Substanzen absorbieren Licht bestimmter Wellenlängen. Ein Spektralphotometer beruht auf folgenden Prinzipien:

1. Ein Lichtstrahl wird durch ein Prismas (oder Gitters) in seine Spektralfarben zerlegt.
2. Mit Hilfe eines Spalts können einzelne Wellenlängen herausgeschnitten werden. Man erhält monochromatisches (= einfarbiges ) Licht.
3. Eine Photozelle, auf die der Strahl des monochromatischen Lichts fällt, wandelt die Lichtenergie in elektrische Energie um, welche an einem Amperemeter abgelesen werden kann.
4. In den Strahlengang kann eine Analysenprobe (K) gestellt werden, was zu einer Verringerung der Lichtmenge führt, welche die Photozelle trifft.

Um eine Substanz zu analysieren, muß man zunächst einmal wissen, bei welcher Lichtwellenlänge sie ein Absorptionsmaximum hat, d.h. man muß das Absorptionsspektrum bestimmen. Hat man das getan, hat man bereits ein charakteristisches, für analytische Zwecke sehr wertvolles Merkmal. Als Beispiel sei hier das Spektrum des Biuretfarbstoffes gebracht, weil es sich hier um den Stoff handelt, den wir am heutigen Nachmittag noch näher kennenlernen wollen.

Aus dem Spektrum können wir ablesen, daß der Farbstoff bei lambda = 550 nm sein Absorptionsmaximum hat. Das ist auch der Grund, warum wir heute alle Messungen mit Licht dieser Wellenlänge durchführen werden.

Auf der Ordinate der folgenden Abbildung sind Extinktionswerte (E) aufgetragen. Extinktion heißt Auslöschung. Je höher E bei einer bestimmten Wellenlänge ist, desto höher ist die Konzentration der betreffenden Substanz. E ist nämlich das Verhältnis des log. des einfallendes Lichts (I₀) zum transmittierten (durch die Probe hindurchgegangenen Lichts (I).

Eine Probe kann durch drei Größen charakterisiert sein.

1. Spezifität der Substanz: charakterisiert durch eine Materialkonstante, den molaren Extinktionskoeffizienten (E')
2. Konzentration (c)
3. Schichtdicke des Probengefäßes (= Küvette) (d)

Je dicker sie ist, desto länger ist der Lichtweg und desto mehr Licht wird absorbiert. Die Extinktion ist somit durch folgende Beziehung zu beschreiben

Im Vorgriff auf späteres können wir nunmehr eine Eichkurve aufstellen, wobei wir wiederum beim Biuretfarbstoff bleiben. Hierbei sind wir folgendermaßen vorgegangen. Wir haben eine Lösung aus reinem Hühnereiweiß (Albumin) hergestellt, welche 20 mg / ml enthielt (bestimmt durch Einwiegen des Albumins) und haben in dem Testsystem, welches Sie bald kennenlernen werden, 9 Ansätze durchgeführt, wobei wir steigende Mengen des Albumins eingesetzt haben. Wie Sie aus der Abbildung erkennen, ist die Extinktion der Konzentration des Albumins im Versuchsansatz direkt proportional. Wir haben somit eine Eichkurve erhalten, die Sie später noch brauchen werden. Soweit zunächst einmal zur Theorie.

Ihnen steht im Praktikum das Spektralphotometer ED 1204 der Firma BECKMAN zur Verfügung. Dieses Gerät ist als Lehrgerät konzipiert und kann auch an Schulen eingesetzt werden. Es bietet vor allem den Vorteil, daß man genau sieht, was geschieht, und Sie die Möglichkeit haben, sich mit den Grundlagen der Photometrie vertraut machen zu können. Das Gerät hat einen aufklappbaren Deckel. Sie erkennen bei geöffnetem Deckel ein Empfängergehäuse, das sowohl die Photozelle, wie auch eine Halterung für das Probengefäß enthält. Sie können bei eingeschaltetem Gerät verfolgen, welcher Ausschnitt des Spektrums durch den Spalt auf der Vorderseite des Gehäuses auf die Photozelle trifft.

Sie können bei diesem Gerät Skalenteile ablesen, aber nicht direkt die Wellenlänge in nm. Die Wellenlänge wiederum kann über eine Eichkurve festgelegt werden. Auch diese Arbeit haben wir Ihnen bereits abgenommen. Wir haben mit jedem der Geräte, die im Praktikum eingesetzt werden, ein farbiges Glasfilter vermessen, von dem wir wußten, bei welchen Wellenlängen es absorbiert. Somit ließen sich Skalenteile und Wellenlänge in Beziehung zueinander setzen.

Achtung: Diese Angaben stimmen nur solange, solange niemand am Feststellhebel spielt. Wer das dennoch tut, muß das Gerät neu eichen, und das dauert für einen Anfänger etwa einen halben Tag. Bitte setzen Sie den Erfolg der Arbeit Ihrer Kommilitonen nicht aufs Spiel.

Teurere Geräte, wie man sie in Forschungslabors sieht, haben den Nachteil, daß man nicht sieht, was geschieht.

Sie haben dennoch einige Vorteile:

1. Der Lichtstrahl wird nicht an einem Prisma gebrochen, sondern an einem Gitter gebeugt. Hierduch erreicht man eine höhere Wellenlängenauflösung.

2. Mit solchen Geräten kann man oftmals nicht nur Licht des sichtbaren Bereichs ausnutzen, sondern auch das des UV Bereichs und das ist besonders für Biologen interessant, weil viele Moleküle (Nukleinsäuren, Nukleotide, Proteine u.a.) in dem Bereich ein Absorptionsmaximum haben. (Es gibt natürlich auch Spektralphotometer, die im infraroten Bereich arbeiten, doch die interessieren die Organchemiker mehr als die Biologen).

1. Stellen Sie die richtige Wellenlänge ein (lambda = 550 nm ) =..... Skt. (vgl. Sie die neben dem Gerät liegende Eichkurve). Achten Sie bitte darauf, die Einstellung so vorzunehmen, daß Sie stets von niedrigeren zu höheren Werten gehen. Haben Sie einen zu hohen Wert eingestellt, drehen Sie die Einstellung ganz zurück und beginnen Sie von neuem.

2. Stellen Sie eine Küvette mit der Referenzsubstanz in den Lichtweg (im Empfängergehäuse). Eine Referenzsubstanz ist ein Blindwert, der alles enthält (Lösungsmittel, Reagenz etc.) bis auf die eigentliche Probe. (Details später).

3. Sperren Sie den Lichtweg. Sie sehen sofort, was geschieht. Stellen den Zeiger der Anzeigenskala auf 0, d.h. 0% Transmission (Durchlässigkeit). Öffnen Sie dann den Lichtweg (Der Zeiger mußt jetzt ausschlagen). Stellen Sie jetzt den Wert auf 100% ein; also auf die maximal ablesbare Empfindlichkeit. Schaffen Sie es nicht, so können Sie eine höhere Empfindlichkeitsstufe des Geräts einschalten. Die Emmission der Lampe ist selbstverständlich auch wellenlängenabhängig. Sie können erkennen, daß z. B. im blauen Bereich eine höhere Empfindlichkeitsstufe eingestellt werden muß, als im roten Bereich weil die Emmission in letzterem Bereich ein Maximum erreicht.

4. Sind 0% und 100% Punkt eingestellt, schließen Sie den Lichtweg. Nehmen Sie die Küvette mit der Referenzsubstanz heraus, und ersetzen Sie sie durch die Küvette, die Ihre Analysenprobe enthält. Öffnen Sie den Lichtweg und lesen Sie E ab.

1. Schlagen Sie ein Ei auf, trennen Sie Eigelb vom Eiklar. Gießen Sie das Eiklar in den Meßzylinder, um das Gesamtvolumen zu bestimmen.

2. Verdünnen Sie das Eiklar 1 : 10 (= 2 ml Eiklar + 18 ml H₂O). Prinzipiell: 1 : 10 heißt 1 + 9 etc.
[1 : X = 1 + ( X - 1)]

3. Sie brauchen 9 Reagenzgläser, die Sie wie folgt mit dem verdünnten Eiklar beschicken

4. Sie finden auf Ihrem Arbeitsplatz eine Standardeichlösung, welche 20 mg / ml Albumin enthält. Entnehmen Sie davon 1.0 und 3.0 ml und beschicken Sie damit die beiden restlichen Gläschen ( 8 und 9 ). Diese Werte brauchen Sie, um Ihre Extinktstionswerte später auf mg / ml zu beziehen.

5. Füllen Sie alle Gläschen mit H₂O auf 5,0 ml auf und geben Sie darauf je 0,5 ml 2 n NaOH hinzu. Stellen Sie die Proben in ein Wasserbad (Temperatur ca. 95°C). Durch diesen Schritt wird das Eiweiß partiell hydrolysiert.

6. Nachdem die Proben abgekühlt sind, pipettieren Sie 4,5 ml Biuretreagenz hinzu, dann 30 min. bei Zimmertemperatur stehenlassen.

7. Extinktionen messen

Gläschen 1 ist der Blindwert. Wie Sie sehen werden, ist auch diese Lösung gefärbt.

Wie würden Sie die Extinktionen dieser Probe bestimmen, wenn man Sie vor diese Aufgabe stellen würde ?

Tragen Sie die Extinktionswerte gegen die eingesetzten Eiweißmengen auf.

Wieviel mg Eiweiß enthält Eiklar pro ml?
Wieviel Eiweiß ist im Hühnerei enthalten?