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1.08. Makromoleküle in Leberzellen

Arbeiten in Zweiergruppen

Filzstift (wasserunlösliche Schrift!)

ein Stück Leber (vom Rind)
Quarzsand (= Seesand)
1 Mörser mit Pistill
6 Zentrifugengläser
Drahtgestell für Zentrifugengläser
20 Reagenzgläser
Reagenzglasgestell
Behälter mit Eis
Tris - HCl- Puffer ( 0,05 m pH 8.0 ) (500 ml einer 0,1 m Trishydroxymethylaminomethanlösung werden mit 0,1 m HCl auf pH 9.0 titriert. Anschließend wird mit H₂O auf 100 ml aufgefüllt. )
2 n HCl
2 n NaOH
4 n NaOH
NaCl ( 10%ig )
Trichloressigsäure (TCA); engl.: trichloracidic acid: 5%ig
Alkohol (vergällt)
Reagenz auf Glykogen
Jod - Jodkaliumlösung (Lugolsche Lösung): 1 g Jod und 2 g KJ pro 300 ml Aqua dest
Pipetten:

20 á 1 ml
20 á 10 ml

Reagenz auf Nukleinsäuren (Dische- Reagenz): 0,5 g Diphenylamin gelöst in 50 ml Eisessig unter Zusatz von 1,5 ml konzentrierter H₂S0₄.
Reagenz auf Protein: Biuret- Reagenz

Zentrifugen (Leistung bei maximaler Belastung: ca. 3500 Umdrehungen / min).
Wasserbäder, eingestellt auf ca. 95°C.
Reagenzglasgestelle

An diesem Nachmittag sollen Sie einige biochemische Arbeitsmethoden kennenlernen und bei der Gelegenheit einige der unterschiedlichen Eigenschaften der wichtigsten Klassen von Makromolekülen einer Zelle untersuchen.

Sie werden im Verlauf des Experiments Kohlenhydrate (Glykogen), Nukleinsäuren und Proteine isolieren und getrennt nachweisen. Dabei werden Sie einige Unterschiede zur Arbeitsweise in einem chemischen Labor feststellen:

	Niederschläge werden nicht filtriert, sondern abzentrifugiert.
	Lösungen werden nicht zusammengegossen, sondern pipettiert. (Während der Vorbesprechung wird die Benutzung einer Pipette demonstriert, Pipettierhilfe - Peleusball - verwenden.)
	Sie brauchen für die einzelnen Reaktionsschritte viel Zeit.
	Nukleinsäuren z.B. fallen nach Alkoholzugabe (Details später) nicht schlagartig aus wie das Silberchlorid beim Chloridnachweis, sondern erst nach und nach, so daß die Reaktion erst nach 15 - 30 min. als abgeschlossen gelten kann.
	Makromoleküle sind empfindlich. Viele Reaktionen müssen deshalb in der Kälte ausgeführt werden.

Trotz all dieser Bemerkungen und Vorsichtsmaßnahmen müssen wir uns im Klaren darüber sein, daß die heutigen Versuche nicht viel mehr als reine Stoffchemie sind. Die doch sehr rauhe Behandlung mit TCA, HCl oder NaOH überstehen nur wenige Makromoleküle unbeschadet. Ein Biologe (Biochemiker oder Molekularbiologe) ist an den Nachweisen, die wir heute durchführen, nur bedingt interessiert. Ihn interessiert vor allem die Funktion der Moleküle, eine spezifische Aktivität eines Proteins (Enzyms), die Fähigkeit der Nukleinsäure, Erbeigenschaften zu übertragen u.s.w. Für Aktivitätsnachweise brauchen wir noch schonendere Methoden, als die, die Sie heute kennenlernen. Zu Ihrer Beruhigung sei gesagt, daß die Arbeitsweise gleich ist, daß Sie dabei u.a. aber folgende Richtlinien zu beachten hätten:

mildere Fällungs- und Extraktionsmittel benutzen

genaue Einstellung der Molarität und des pH- Werts

Einhalten der Temperatur.

Scherkräfte, welche z.B. beim Pipettieren auftreten, auf ein Minimum reduzieren.

Diese Techniken behalten wir für spätere Nachmittage und die Fortgeschrittenenpraktika vor.

Lebergewebe wird zerkleinert und mit Trichloressigsäure (TCA) versetzt. Hierbei denaturieren Nukleinsäuren und Proteine. Glykogen bleibt in Lösung. Nach dem Abtrennen des Sediments wird die Nukleinsäure mit einer konzentrierten Salzlösung daraus extrahiert. Das unlösliche Protein kann zum Teil durch NaOH hydrolysiert und somit wieder in Lösung gebracht werden. Die einzelnen Fraktionen werden jeweils mit spezifischen Reagenzien auf die unterschiedlichen Molekülklassen hin analysiert.

Das Leberstück wird mit etwa der gleichen Menge Seesand im Mörser homogenisiert, bis keine Gewebestücke mehr zu erkennen sind. Den Gewebebrei versetzt man mit 20 ml TCA, reibt ca. 1 min. weiter (Protokollieren Sie Ihre Beobachtungen!). Die Suspension wird nach kurzem Stehenlassen in ein Zentrifugenglas überführt. Durch das Stehenlassen (ca. 1 min.) sedimentiert der Sand, den wir nicht mehr brauchen und von dem so wenig wie möglich in das Zentrifugenglas abgegossen werden soll.

1. Stets darauf achten, daß gegenüberstehende Zentrifugengläser gleich schwer sind (in unserem Fall genügt das Augenmaß; die beiden Zentrifugengläser müssen gleiche Volumina enthalten.) Soll nur 1 Probenglas zentrifugiert werden, so braucht man ein mit der gleichen Wassermenge gefülltes Gegenglas (Tarierglas). Gläser stets beschriften, um Verwechslungen vorzubeugen.

2. Es arbeiten immer mehrere Arbeitsgruppen an einem Gerät, deshalb stets auf optimale Ausnutzung achten. Leerlauf vermeiden. In einer Zentrifuge haben 4 Gläser Platz, also nicht mit nur 2 Gläsern fahren und die Nachbargruppe warten lassen!

3. Bei Unregelmäßigkeiten im Lauf sofort abschalten, prüfen worauf die Unwucht beruht. (Oft ist es ein drittes, vom letzten Lauf vergessenes Tarierglas.)

4. Die Geschwindigkeit kann am linken Schalter eingestellt werden. (Ein Geschwindigkeitsmesser fehlt bei fast allen Geräten.) Arbeiten Sie bei Höchstgeschwindigkeit. Am rechten Schalter kann die Zentrifugationszeit eingestellt werden. Das Gerät schaltet automatisch ab.

Die Suspension wird 5 min. lang zentrifugiert. Sie erhalten ein Sediment (S₁) und einen Überstand ( Ü₁), 15 ml von Ü₁ werden in ein zweites Zentrifugenglas pipettiert. Hierzu gibt man 30 ml Alkohol und stellt das Glas ins Eis. Beobachten, was geschieht.

Nach ca. 30 min. zentrifugiert man den sich bildenden Niederschlag ab. Man erhält S₂ und Ü₂, Ü₂ wird verworfen.

S₂ wird in 5 ml Trispuffer gelöst. (5 ml Puffer auf das Sediment pipettieren und Glas vorsichtig schwenken, bis sich alles gelöst hat.) Die Fraktion S₂ für nachfolgende Analysen aufheben.

Unabhängig davon S₁ weiterverarbeiten:

20 ml einer 10 %igen NaCl- Lösung hinzugeben und das Sediment darin so gut wie möglich suspendieren, dann die Suspension für 10 min. im Wasserbad auf 95°C erhitzen, anschließend nach dem Abkühlen wieder 5 min. zentrifugieren. Man erhält S₃ und Ü₃:

zu 15 ml von Ü₃ werden 30 ml Alkohol gegeben, die Mischung dann für ca. 30 min. ins Eis gestellt; erneut zentrifugieren: S₄ und Ü₄:

Ü₄ verwerfen. S₄ (wie S₂) in 5 ml Trispuffer lösen und aufheben.

S₃ in 20 ml 4 n NaOH suspendieren und für 10 min. auf 95°C erhitzen, dann wieder zentrifugieren : S₅ und Ü₅.

Ü₅ abpipettieren und für Analyse aufheben.

Es bleiben somit übrig: S₂, S₄, Ü₅

Als Kontrolle (K) setzt man an: 5 ml Trispuffer. K, S₂, S₄ und Ü₅ werden nun auf Glykogen, Protein und Nukleinsäure hin untersucht.

Glykogen gibt bei Zugabe von Jod - Jodkaliumlösung im sauren Bereich eine rotbraune Färbung.

Versuchsansatz

0,5 ml Probe
+ 0,5 ml 2 n HCl
+ 4,0 ml Wasser (Aqua dest.)
+ 1,0 ml Jod - Jodkaiiumlösung

als weitere Kontrolle

0,5 ml S₂
+ 0,5 ml 2 n NaOH
+ 4,0 ml Wasser
+ 1,0 ml Jod - Jodkaliumlösung

Welche Reaktionen ergeben K, S₂ (sauer), S₂ (alkalisch), S₄ und Ü₅ ?

Welche enthalten Glykogen?
Erinnern Sie sich an die Pyrenoidkörner in Spirogyra, und an die Hefezellen?

Protein wird mit der Biuretmethode (Alternative: Coomassie-Färbung) nachgewiesen. (vgl. vorigen Praktikumsnachmittag)

0,5 ml Probe
+ 4,0 ml Wasser
+ 0,5 ml 2 n NaOH ( bei Ü₅ durch H₂O ersetzen, Warum?)

Die Proben 5 auf 95°C erhitzen, dann 4,5 ml Biuretreagenz hinzugeben, 30 min. stehenlassen, Färbung protokollieren.

Weiche Proben enthalten Protein?

Beim Trennverfahren unterscheiden wir nicht zwischen Ribonukleinsäure (RNS) und Desoxyribonukleinsäure (DNS). Wir testen aber nur auf DNS. Die DNS enthält den Zucker Desoxyribose, der mit Diphenylamin eine Blaufärbung ergibt.

Reaktionsansatz

1 ml Probe
+ 2 ml Diphenylamin (Dische Reagenz) für 10 min, ins Wasserbad (95°C) stellen.

Fassen Sie Ihre Ergebnisse tabellarisch zusammen.

Was können Sie aus den Ergebnissen schließen?
Welche Fraktionen sind "sauber", welche nicht?
Gibt es eine plausible Erklärung für eventuelle "Verunreinigungen"?

Sie müssen sich im Klaren darüber sein, daß die Reinheitskriterien nur auf Grund der angewandten Testverfahren Gültigkeit haben. Eine Fraktion, die DNS enthält, kann auch RNS enthalten, - wir haben mit unseren Methoden jedoch nicht auf RNS hin getestet.

Die Nachweise, die Sie an diesem Nachmittag kennengelernt haben, können wie z. B. die Biuretmethode, auch für quantitative Untersuchungen eingesetzt werden (Photometrie). Wir verzichten heute darauf, weil uns eine sinnvolle Bezugsgröße fehlt.

Welche Bezugsgröße wäre sinnvoll und wie könnten wir sie erhalten?