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Filzschreiber (wasserunlöslich)
Streichhölzer oder Feuerzeug

Bakteriensuspension
20 Petrischalen mit Agar (Agarplatten) hergestellt nach folgender Vorschrift:

15 g Agar,10 g Pepton, 5 g NaCl, 2 g Na-citrat und 1,3 g Glucose wurden in 1000 ml Aqua dest. gelöst und durch autoklavieren sterilisiert: eine Agarplatte enthält ca. 25 - 30 ml der sterilen Lösung, welche beim Abkühlen zu einem Gel erstarrt.

50 ml sterile (autoklavierte) Nährbrühe:

10 g Pepton, 5 g NaCl, 1,3 g Glucose, gelöst in 1000 ml H₂O; anschließend autoklaviert.

2 x 100 ml steriles Wasser
Pipetten : Pipettenbüchsen nur bei Gebrauch öffnen

50 á 0,1 ml
20 á 1.0 ml
20 á 10 ml

1 Glasbügel zum Ausplattieren (in Alufohe verpackt)
2 Kulturröhrchen mit Alukappe und Belüftungsrohr (zerbrechlich !)
48 sterile Glasröhrchen mit Alu - Kappe verschlossen
2 Reagenzglasgestelle
1 Laborgasbrenner
1 Becherglas mit absolutem (vergälltem) Alkohol
Mikroskop
Zählkammer nach BÜRKER mit Deckglas
Kleenex - Tücher
Pasteurpipetten mit Hütchen

Stutzen, gefüllt mit Wasser, als Ablage benutzter Pipetten.
Brutschränke, eingestellt auf 37°C
Wasserbäder, eingestellt auf 37°C mit Gestellen für Kulturröhrchen, dazu je eine Belüftungsanlage
Spektralphotometer (eingestellt auf lambda = 550 nm)
Küvetten (kleine Reagenzgläser)

Bakterien sind sehr schnell wachsende Zellen. Wir bedienen uns deshalb ihrer, um eine Wachstumskinetik aufzustellen und um ihre Generationsdauer zu bestimmen. Außerdem wollen wir die Gelegenheit wahrnehmen, einige für die Bakteriologie und die Molekulare Genetik grundlegende Techniken kennenzulernen und dabei Ergebnisse, die mit unterschiedlichen Techniken gewonnen werden, vergleichen.

Die Devise des Tages lautet

Das heutige Experiment ist das schwierigste des Praktikums. Es erfordert außerordentliche Disziplin. Das Experiment besteht aus mehreren Schritten, die nacheinander ausgeführt werden müssen. Einer ist so wichtig wie der andere. Außerdem haben Sie ein gegebenes Zeitschema exakt zu befolgen. Sollten Sie - aus welchen Gründen auch immer - von der Vorschrift abweichen, machen Sie darüber eine Protokollnotiz.

Sie finden an Ihrem Arbeitsplatz eine Reihe von Hilfsmitteln vor, die sterilisiert wurden und steril in Aluminiumfolie verpackt sind. Überzeugen Sie sich, daß die Ausrüstung Ihres Arbeitsplatzes komplett ist. Sie arbeiten wieder in Zweiergruppen. Lesen Sie zusammen mit Ihrem Partner die Versuchsanleitung vor Beginn des Versuchs nochmals durch, durchdenken Sie jeden Handgriff und legen Sie sich die nötigen Geräte zurecht. Vermeiden Sie jegliche Hast und unnötiges Herumlaufen im Raum. Erst wenn Sie sicher sind, daß alle Hilfsmittel bereitliegen, sollten Sie mit dem Experiment beginnen. Wasserbäder, Brutschränke und Photometer stehen mehreren Gruppen zur Verfügung. Nehmen Sie bei deren Benutzung Rücksicht auf die anderen beteiligten Gruppen. Beschriften Sie grundsätzlich alle Ihre Proben mit Ihrer Gruppennummer (= Platznummer eines der Partner). Es hilft, wenn Sie daran denken, daß Ihre Finger, Ihr Atem und die Luft im Raum voller Bakterien sind (den Beweis werden wir am kommenden Versuchsnachmittag erbringen).
Die sterilen Platten, Gläser und Pipetten sollten daher so wenig wie möglich damit in Berührung kommen. Nehmen Sie die Aluminiumkappen nur dann von den einzelnen Röhrchen ab, wenn Sie das betreffende Röhrchen benutzen. Wechseln Sie die Pipetten, wie angegeben, aber achten Sie darauf, daß Ihnen nur eine beschränkte Anzahl zur Verfügung steht. Öffnen Sie die Pipettenbüchsen nur zur Entnahme einer Pipette, schließen Sie sie darauf umgehend wieder.

Einige Handgriffe, die das Arbeiten stark erleichtern, werden bei der Vorbesprechung demonstriert .z.B. : der kleine Finger der rechten Hand dient zum Festhalten von Aluminiumkappen, mit denen die kleinen Gläschen verschlossen sind. Klemmen Sie die Kappe mit dem kleinen Finger ein und Sie haben die übrigen Finger und die linke Hand für die übrigen Handgriffe frei.

Sie haben gelernt, daß man Konzentrationen gefärbter Substanzen photometrisch bestimmen kann.

Eine Bakteriensuspension ist trüb, weil sie ein Teil des hindurchtretenden Lichts streut. Diesen Streulichtverlust kann man photometrisch bestimmen. Je höher die Konzentration der Suspension ist, desto mehr Licht wird gestreut. Natürlich spielt auch Absorption eine Rolle. Die beiden physikochemisch voneinander verschiedenen Phänomene lassen sich mit unseren Mitteln experimentell nur schwer auseinanderhalten. Wir können ein Optimum anstreben, indem wir die Streuung bei einer Wellenlänge messen, bei der die Bakterien und die Nährlösung ein Absorptionsminimum haben. Ein solches Minimum liegt bei lambda = 550 nm. Auf diesen Wert sind die Photometer heute eingestellt worden.

Bakterien kann man mikroskopisch recht gut erkennen, z. B. bereits bei 400facher Vergrößerung. Noch bessser geht es mit der Ihnen zur Verfügung stehenden Phasenkontrasteinrichtung.

Man kann Bakterien unter dem Mikroskop direkt auszählen. Man braucht hierfür eine spezielle Zählkammer mit exakt angegebenen Volumen. Solche Kammern werden in erster Linie für den Einsatz in klinischen Labors zum Auszählen von Blutzellen hergestellt. Man bezeichnet sie deshalb auch als Hämatozymeter. Wir werden mit ihrer Hilfe im Praktikum Bakterien auszählen. Das Verfahren hat aber einige schwerwiegende Nachteile. Es eignet sich nämlich nur dann, wenn einem konzentrierte und vor allem reine Bakteriensuspensionen zur Verfügung stehen. Bakterien im Boden, auch an den Fingern etc. können Sie auf diese Weise nicht auszählen, dafür ist die Zahl zu gering, vor allem wird es Ihnen sehr schwer fallen, ein Bakterium eindeutig von Schmutz- oder anderen Partikeln zu unterscheiden.

Ein zweiter Nachteil des Verfahrens liegt darin, daß Sie ein einzelnes Bakterium zwar sehen können, es aber nicht isolieren und weiterkultivieren können und letzteres ist besonders für Molekulargenetiker wichtig, die sich ja für die Nachkommenschaft von Individuen interessieren. Es ist leichter und viel genauer, eine kleine Menge (ein Aliquot) der Suspension (stark verdünnt) auf eine Agarplatte zu bringen, sie dort gleichmäßig zu verstreichen und abzuwarten, bis die einzelnen Bakterien zu einer Kolonie ausgewachsen sind, die man dann leicht erkennen und auszählen kann. Da man die Verdüunungsfaktoren kennt (zumindest kennen sollte) kann man die Ausgangskonzentration errechnen. Man bebrütet die infizierten Platten bei 37°C. Die Kolonien werden nach einigen Stunden sichtbar. Normalerweise erfolgt eine Auswertung am folgenden Tage. Da das im Praktikum Schwierigkeiten bereiten würde, werden die für 24 h bebrüteten Platten von uns in den Kühlschrank gestellt, wo sie über längere Zeit haltbar bleiben ohne daß die Bakterien ein nennenswertes Wachstum zeigen. An diesem Experiment, das, wie Sie noch sehen werden, zu sehr genauen Ergebnissen führt, sofern Sie sich strikt an die Spielregeln halten, können Sie etwas Entscheidendes lernen, nämlich den Unterschied zwischen klassischer Biologie und Physik.

In der klassischen Biologie, speziell in der Morphologie, hat man es mit spezifischen Strukturen zu tun, die man direkt oder unter Zuhilfenahme eines Mikroskops sehen kann, (vgl. Zwiebelzelle, Holz, Anatomie des Frosches etc.). In der Physik (und Chemie) beschäftigt man sich mit Strukturen (Elementarteilchen, Atome, Moleküle), die man nicht sieht, sondern deren Wirkungen man untersucht (z. B. die Spur eines Elementarteilchens in einer Nebel- oder Blasenkammer). Genau das gleiche Konzept liegt unseren Beobachtungen zugrunde. Die Bakterien, mit denen wir die Agarplatten infiziert haben, sind für uns nicht erkennbar. Sie haben sich geteilt und sind somit unwiederbringlich verloren. Wir können festhalten; eine Kolonie ist die Nachkommenschaft nur eines Teilchens, wir sehen somit die Auswirkung des Vermehrungs-, resp. Teilungsprozesses.

Bakterien vermehrten sich durch Zweiteilung, was wir durch den Ausdruck

N_t =N₀2ⁿ

beschreiben können. wobei N_t die Anzahl der Bakterien zu einem bestimmten Zeitpunkt, N₀ die Anzahl zu Versuchsbeginn und n die Zahl der Generationen ist. Immer, wo man es mit Exponenten zu tun hat, kommt man schnell auf hohe Zahlen,

Bakterien - wir arbeiten hier vor allem mit dem Darmbakterium Escherichia coli (abgekürzt E. coli) - wachsen bis zu einer Dichte von 2-3 x 10⁹ Zellen / ml heran. Es ist selbst mit guter Nährlösung nicht möglich, sie zu einer noch höheren Konzentration wachsen zu lassen, weil Ausscheidungsprodukte eine stärkere Vermehrung hemmen. Betrachtet man eine Wachstumskinetik von Bakterien, so kann man 4 Phasen voneinander unterscheiden:

1. die lag- Phase. Hier findet ein verzögertes Wachstum statt. Die Bakterien müssen sich erst an die neue Umwelt adaptieren und den Stoffwechsel auf Teilung einstellen.
2. die logarithmische Wachstumsphase. Hier findet optimales Teilungswachstum statt.
3. die stationäre Phase, die Teilungsrate nimmt ab, sie steht mit der Abbaurate im Gleichgewicht.
4. eine Abbauphase. Die Anzahl lebender Keime nimmt ab, da viele von ihnen durch die Aussoheidungsprodukte abgetötet werden.
   

Es dauert einige Stunden (ca. 8), bis die statioräre Phase erreicht ist. Zur Herstellung einer solchen Bakterienkultur beimpft man eine Nährlösung in der Regel am Abend und hat dann am kommenden Morgen das erwartete Ergebnis. Da man das routinemäßig (!) in Laboratorien auf der ganzen Welt so macht, spricht man generell von Übernachtkultur (ÜNK) engl.: overnight culture Nach allen Erfahrungen kann man davon ausgehen, daß eine solche ÜNK stets 2-3 x 10⁹ Bakterien / ml enthält.

Wir haben im Praktikum nur ca. 3 Stunden Zeit, in der Sie optimales Wachstum messen sollen. Soetwas geht experimentell nur durch einen "fliegenden Start", bei dem die Beschleunigungsphase (lag- Phase) ausgeschaltet wird. Wir haben deshalb bereits einige Vorbereitungen getroffen. Morgens um 8 Uhr wurde ein Kulturröhrchen, welches 19,8 ml Nährlösung enthielt, mit 0,2 ml einer ÜNK beimpft. Die Kultur wurde bis Praktikumsbeginn bei 37°C inkubiert und belüftet - also bei den gleichen Bedingungen, bei denen auch Sie arbeiten werden. Wir haben somit Bakterien in der logarithmischen Wachstumsphase erhalten. Diese Bakterien erhalten Sie als Ausgangsmaterial. Sie brauchen sie daher nur mit der gleichen Nährlösung zu verdünnen und können sofort mit den Messungen beginnen. Da sich die Umweltbedingungen während der Verdünnung für die Bakterien praktisch nicht ändern, beobachten Sie den Fortgang des Wachstums und haben somit die Gelegenheit, die unter unseren Bedingungen optimale Teilungsrate messen zu können.

Unter Titer versteht man Partikel / ml. Man schätzt den Titer der Ausgangslösung oder glaubt der Angabe der Praktikumsleitung.
Sie erhalten von uns als Ausgangslösung ca.1-5 x 10⁸ Bakterien / ml. Da Sie diese Ausgangslösung zu Versuchsbeginn 1 : 10 verdünnen werden, haben Sie zum Zeitpunkt t = 0 ca. 1-5 x 10⁷ Bakterien / ml in Ihrem Versuchsansatz.

Auf einer Agarplatte ist nicht beliebig viel Platz. 100 Kolonien sind eine gut zählbare Menge. Es ist daher das Ziel und die Kunst, die Ausgangslösung richtig zu verdünnen. also: (1-5 x)10⁷ muß auf 10² verdünnt werden. Der Verdünnungsfaktor ist somit (1-5 x)10^-5. Um sicher zu gehen, stellen wir nicht nur diese Verdünnung her, sondern wir variieren um 2 weitere Zehnerpotenzen

10^-4 und 10^-6

Wenn unser Ansatz und vor allem der Ausgangswert stimmt, müssten wir bei einer Verdünnung von

1. 10^-4 1000 - 5000 Kolonien / Platte
2. 10^-5 100 - 500 Kolonien / Platte
3. 10^-6 10 - 50 Kolonien / Platte

erhalten. Bei sehr hohen Konzentrationen verschmelzen die Kolonien zu einem Bakterienrasen, die Platte

1. wäre mit Sicherheit nicht auswertbar.
2. möglicherweise auch nicht.
3. wäre leicht auszählbar.

Das Risiko, nicht auswertbare Platten zu erhalten, müssen wir in Kauf nehmen.

Grundsätzlich in einem Schritt nicht stärker als 1 : 100 verdünnen. Daraus folgt: es müssen mehrere Verdünnungsschritte hintereinander folgen. Am günstigsten: bei jedem Verdünnungsschritt 4,5 ml Verdünnungsmedium (Wasser) + 0,5 ml Bakteriensuspension einsetzen.

Pipettieren Sie 18 ml Nährlösung in das Kulturröhrchen, geben Sie 2 ml der Bakteriensuspension (Ausgangslösung) hinzu, mischen Sie durch Schütteln, entnehmen Sie daraus 2 ml und pipettieren Sie diese in ein kleines sterilisiertes Reagenzglas. Stellen Sie das Kulturröhrchen in das Wasserbad und schließen Sie es an die Belüftungsanlage an. Vorsicht: die Spitze des Belüftungsrohrs ist sehr bruchempfindlich. (Für alle Fälle: Sie haben ein Ersatzgläschen).

Entnehmen Sie aus dem Kulturröhrchen steril 2 ml Proben zu folgenden Zeiten

0 min.
45 min.
90 min.
135 min.
180 min.

Stellen Sie sich die kleinen Röhrchen zurecht, beschriften Sie sie mit 1,2,3,4,......

Füllen Sie die Röhrchen 2 - 7 mit je 4,5 ml sterilem Wasser. Verdünnen Sie sukzessive laut Schema Ihre Probe in diese Röhrchen hinein. Sie erhalten dann

Plattieren Sie von den Verdünnungen : 4, 5 und 6 je 0,05 ml auf je eine Agarschale. Da Sie nur 1 / 20 eines ml verwenden, müssen Sie diesen Faktor bei der späteren Titerberechnung mit berücksichtigen. Dieses Volumen (mit einer 0,1 ml Pipette zu pipettieren) hat sich zum Ausplattieren bewährt.

Wichtig: Mit dem sterilen Glasbügel wird der 0,05 ml Tropfen auf der Platte gleichmäßig verteilt, bis die Oberfläche völlig trocken ist. Beim Abheben des Bügels darf kein Tropfen stehenbleiben, andernfalls sehen Sie später ineinandergelaufene Kolonien, die Sie nicht mehr zählen können. Plattieren Sie zunächst die stärkste Verdünnung aus und zuletzt die schwächste. Sie können das alles mit dem einen Bügel tun, ohne ihn zwischendurch zu sterilisieren, da Sie eine Suspension vieler Bakterien nicht durch eine Spur einer Suspension von nur wenigen verunreinigen können.
Wenn Sie mit einem Zeitpunkt fertig sind, wird der Glasbügel sterilisiert: in Alkohol tauchen und mit der Gasflamme den Alkohol entzünden. Glasbügel nicht in der Flamme lassen, sonst verrußt er. Alkoholfrei abbrennen lassen. Ca. 1 min. abkühlen lassen; dann wiederverwenden.
Stellen Sie alle Platten, gut gekennzeichnet, (Gruppennummer, Verdünnung, Zeitpunkt) verkehrt herum in den Brutschrank. Verkehrt herum (die Agarschicht soll im Deckel sein), um zu verhindern, daß Kondenswasser auf die Platte herabtropft, denn auch das würde ein Verlaufen der Kolonien verursachen.

Diesen Ergebnissen, die Sie allerdings frühestens erst am folgenden Tage oder am folgenden Praktikumsnachmittag auszählen können, soll die Zählung und die Trübungsmessung gegenübergestellt werden.

Versuchen Sie zunächst, die 1 : 10 verdünnten Proben auszuzählen. Wenn die Zellzahl zu hoch ist, nehmen Sie die 1 : 100 Probe. Hier brauchen Sie nicht mehr steril zu arbeiten, denn die Kultur brauchen Sie ja nun nicht mehr zu irgendwelchen Versuchen, bei denen die Gefahr bestehen würde, daß sie durch andere Mikroorganismen überwachsen würde.

Pipettieren Sie mit einer Pasteurpipette einen kleinen Tropfen in die Rille der Zählkammer. Pressen Sie das Deckglas fest auf, achten Sie, daß sich ein Flüssigkeitsfilm zwischen Kammer und Deckglas bildet. Warten Sie ca. 10 min, bevor Sie mit der Zählung beginnen. Zählen Sie jeweils 5 Felder aus und bilden Sie den Mittelwert. Das Volumen über einem ausgezähltem Feld beträgt 1 / 16 x 10^-4 ml. Durch Multiplikation mit diesem Faktor können Sie von den gezählten Werten auf den Bakterientiter / ml extrapolieren.

	Tragen Sie die Werte in die obige Tabelle mit ein.
	Stellen Sie die Wachstumkinetik der Bakterien auf halblogarithmischem Papier dar.
	Wie gut ist die Korrelation der Werte zueinander, die Sie einmal durch direktes Zählen und zum anderen durch Ausplattieren gewonnen haben?
	Wie lang ist die Generationsdauer unter den gegebenen Bedingungen?

Bestimmen Sie die Konzentration der Suspension (jeweils unverdünnte Probe verwenden) durch Streulichtmessung.

Welche Kinetik erhalten Sie dort?
Ist sie der Zellzahl der Extinktion direkt proportional?
Tragen Sie Extiontion gegen die Zellzahl auf. Sie erhalten somit eine Eichkurve.
Was können Sie aus der Steigung der Kurve schließen?