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sterile Lanzettnadel
absouter Alkohol
Watte
Dokumentationskarte
3 Glasstäbe
Schellack
Pasteurpipetten mit Hütchen
anti - BSA (Antiserum gegen Rinderserumalbumin, hergestellt in Kaninchen)
BSA- Lösung (20 mg / ml)
Hühneralbumin- Lösung (20 mg / ml)
Gestell mit 10 Zentrifugengläsern
Gestell mit 20 Reagenzgläsern
Pipetten :

20 á 0,1 ml
20 á 1.0 ml
20 á 10 ml

100 ml phosphatgepufferte, physiologische Kochsalzlösung (PBS: phosphor buffered saline ) = 0,9 %ige NaCl Lösung in 0,1 m Phosphatpuffer, pH 7.0 )
n / 50 NaOH
Papierhandtücher
Folin - Ciocalteusches Reagenz (1 : 3 verdünnt): hergestellt nach folgender Vorschrift:

100 g NaWO₄ x 2 H₂O ; 25 g NaMoO₄ x 2H₂O ; 700 ml H₂O; 50 ml 85%ige H₃PO₄ und 100 ml conz. HCl. - für 10 Stunden unter Rückfluß kochen, dann 150 g Li₂SO₄, 50 ml H₂0 und einige Tropfen Brom hinzugeben, dann wieder 15 min. kochen, abkühlen lassen, auf 1 l auffüllen, filtrieren - in dunkler Flasche aufheben - fertig ! Man kann das Reagenz aber auch schon fertig kaufen.

12,5 %ige Lösung von Na₂CO₃ (Anhydrid)
0,1 %ige CuSO₄ Lösung
Objektträger mit Agar beschichtet

1,5 g Agar wurden 30 min. in 1 : 1 verdünntem Veronalpuffer gekocht [Veronalpuffer : 0,05 m Veronal - Na (8,5 g / l ) ; pH 8 ; mit 1 n HCl eingestellt], 0,01 % Merthiolat wurden zugesetzt. 2 ml pro Objektträger.

In die erstarrten Proben wurden Löcher gestanzt. Die Objektträger werden in Petrischalen aufgehoben, in denen ein angefeuchtetes Filterpapier liegt, um zu verhindern, daß die Agarschicht austrocknet Die Platten wurden erst wenige Stunden vor Praktikumsbeginn hergestellt.

Antiseren

Anti A
Anti B
Anti A + B

Wasserbäder, eingestellt auf 37° C
Zentrifugen
Spektralphotometer, eingestellt auf lambda = 750 nm
Brutschrank, eingestellt auf 37°C
Feuchthaltekammern (Frühstücksbehälter)

Die Bildung von Antikörpern kann durch Infektion einer Fremdkörpersuspension (eines Antigens) induziert werden. Die gebildeten Antikörper sind spezifisch, d.h. sie reagieren nur mit dem homologen Antigen, dem gleichen, durch das ihre Bildung induziert wurde, oder mit sehr ähnlichen Antigenen (heterologe Antigene). Antikörper sind Eiweißmoleküle, die (vorwiegend) gelöst im Blutplasma vorkommen. Man rechnet sie zu einer bestimmten Bluteiweißfraktion, den gamma-Globulinen (oder Imunglobulinen). Immunglobuline bilden eine heterogene Molekülpopulation , d. h. alle Moleküle zeigen untereinander eine Reihe von Gemeinsamkeiten und Unterschieden.

Die Substanzen, die wir bisher kennengelernt haben, wie die beta - Galactosidase, Amylase, NaCl, H₂O u.s.w. bestehen aus Molekülen, die untereinander alle gleich sind, es sind also homogene Molekülpopulationen.
Wir haben im Praktikum nicht genügend Zeit, um Tiere zu immunisieren und so die Bildung spezifischer Antikörper zu induzieren. Sie erhalten von uns deshalb Serum eines Kaninchens, welchem vorher ein Antigen injiziert worden ist.
Sicher haben Sie eine solche Impfung (Immunisierung selbst auch bereits hinter sich:

Pockenschutzimpfung
Polio - Schutzimpfung (Schluckimpfung).

Der Körper bildet innerhalb weniger Tage (14 - 21) die spezifischen Antikörper. Ein Serum, welches sie enthält, heißt Antiserum. Die Menge an Antiserum im Serum wird als Antikörpertiter bezeichnet. Die Antikörper gehören einer bestimmten Blutplasmaproteinklasse, den gamma-Globulinen an. Blutplasmaproteine lassen sich leicht elektrophoretisch auftrennen. Die Hauptmasse bilden die Albumine
Was Sie an dieser Stelle noch wissen sollten: der Titer in Ihrem Blutserum z. B. von Antikörpern gegen Pockenviren ist sehr wahrscheinlich vernachlässigbar niedrig. Durch eine Untersuchung des Serums zum heutigen Zeitpunkt wäre es ausgeschlossen, zu entscheiden, ob Sie bereits imunisiert worden sind oder nicht. Trotzdem hat sich bei der ersten Immunisierung soetwas wie ein Immunologisches Gedächtnis etabliert, Sobald Sie nämlich ein zweites Mal (zufällig oder nicht) mit dem Antigen in Kontakt kommen, werden unmittelbar danach (also nicht erst nach einer lag - Periode) große Antikörpermengen gebildet und ins Blutserum abgegeben.
Es würde hier zu weit führen, etwas über den Mechanismus der Antikörperbildung zu sagen. Sie sollten aber wissen, daß sich die Vorgänge nicht nur auf rein molekularer Ebene abspielen, sondern auch auf zellulären. Das Kaninchenserum, welches Sie im Kurs erhalten werden, ist mit Rinderserumalbumin (BSA; da engl.: bovine serum albumine) immunisiert worden. Das Serum wurde 3 Wochen nach der Injektion des Antigens gewonnen. (Blutentnahme aus der Ohrvene). Das Serum wurde duch Abzentrifugieren der Blutzellen gewonnen.

BSA haben wir für das heutige Experiment deshalb als Antigen gewählt, weil es uns in reiner Form in größeren Mengen zur Verfügung steht, weil man weiß, daß Kaninchen gut reagierende Antikörper gegen dieses Antigen bilden und, was vielleicht das wichtigste ist, wir kennen eine Reihe weiterer, sehr ähnlicher Albumine. z. B. das Ihnen bereits bekannte Eialbumin. Wir können also prüfen, ob ein Antigen, welches gegen Rinderserumalbumin gerichtet ist, auch mit einem ähnlichen (= heterologen) Antigen wie Eialbumin, reagiert. Man weiß, daß es derartige Kreuzreaktionen gibt. Denken Sie z.B. nur wieder an die Pockenschutzimpfung. Menschen werden nicht mit den humanpathogenen Pockenviren immunisiert, sondern mit den weit harmloseren Kuhpocken.

Ein Antigen kann mit dem Antikörper reagieren. Hierbei bildet sich ein Antigen - Antikörperkomplex, welcher unter bestimmen Bedingungen, die wir später noch untersuchen wollen, als schwerlösliches Präzipitat ausfällt, weil die Moleküle ein umfangreiches Netzwerk bilden. Man kann es abzentrifugieren und die Eiweißmenge bestimmen. Da man vorher festlegen kann, wieviel Antigen man einsetzt, läßt sich aus der Differenz unschwer die Menge präzipitierter Antikörper bestimmen.

Die Problematik der Antikörperbildung und einen kurzen Abriß über die Nachweisverfahren finden Sie in einem Aufsatz im Anhang zu der Versuchsanleitung für diesen Nachmittag. Es ist dort auch beschrieben, wie man zu klaren Ergebnissen kommt, wenn einem nur sehr kleine Mengen an Antigen und Antikörper zur Verfügung stehen. Man arbeitet in den Fällen mit einem Agargeldiffusionstest (nach seinem Erfinder auch OUCHTERLONY - Test genannt). Wir werden mit diesem Test versuchen, nachzuweisen, wie gut unser Antiserum mit heterologen Antigenen kreuzreagiert. Wir werden versuchen, die Äquivalenzzone der Antikörper-Antigen-Reaktion zu bestimmen, den Bereich also, bei dem wir die größte Präzipitatmenge erhalten.

Bisher haben wir zum quantitativen Nachweis von Eiweiß nur mit der Biuret - Reaktion gearbeitet (1.07 und 1.08). Diese Methode ist uns heute nicht empfindlich genug. Sie erfaßt nicht mehr die geringen Eiweißmengen, mit denen wir heute arbeiten werden.
Wir bedienen uns deshalb der viel empfindlicheren Folin Reaktion. (Die Herstellungsvorschrift finden Sie im Methodenteil).
Schließlich sollen Sie heute auch Ihre eigene Blutgruppe bestimmen. Wir stellen Ihnen Testseren zur Verfügung, die es erlauben, eine klare Entscheidung zu treffen. Dieser Versuch hat in Praktika bisher immer zufriedenstellende Ergebnisse gezeigt. Wir müssen Sie allerdings darauf hinweisen, daß die Versuche ohne Aufsicht durch einen approbierten Arzt durchgeführt werden. Die Ergebnisse sind somit im juristischen Sinne nicht verbindlich, obwohl wir den Test genau so durchführen, wie in der Klinik und unsere Seren von der gleichen Quelle stammen (Behring Werke, Marburg).

1. Sie brauchen einen Tropfen eigenes Blut: einer Fingerkuppe entnehmen, eine sterile Lanzettnadel steht dazu zur Verfügung, Finger vorher mit absolutem Alkohol abreiben.
2. Auf die Dokumentationskarte (oder einen Objektträger) je einen Tropfen Antiserum

Anti A : blau
Anti B : gelb
Anti A+B : weiß

3. daneben je einen Tropfen Blut geben. (mit Pasteurpipette)
4. mit Glasstab verrühren (für jedes Serum einen neuen verwenden). Die beiden Tropfen müssen eine homogene Suspension bilden.
5. Nach ca. 1 min. Ergebnis ablesen.
6. Nachdem die Proben vollständig eingetrocknet sind, können Sie sie mit einem farblosen Lack (Schellack) bestreichen und somit konservieren. Die Dokumentationskarte dürfen Sie behalten. (Wir können Ihnen eine solche Karte demonstrieren, die vor 20 Jahren hergestellt wurde).

Ihnen steht ein verdünntes Kaninchen - anti - BSA -Serum zur Verfügung und eine BSA - Lösung (20 mg / ml)

1. Setzen Sie 8 Röhrchen mit steigenden BSA - Mengen an. z.B:

* Da wir den Titer des Serums, mit dem Sie arbeiten werden, noch nicht kennen, betrachten Sie diese Werte nur als Richtwerte.

Genaue Angaben erfahren Sie während der Vorbesprechung.
Füllen Sie alle Röhrchen mit PBS auf 2.0 ml auf. (Vergessen Sie den Blindwert nicht nur PBS ; Gläschen 9).
2. Geben Sie zu jedem der 9 Röhrchen 1 ml des verdünnten Serums hinzu. Dann: Sie brauchen noch eine weitere Kontrolle: Gläschen 10: 2 ml BSA und 1 ml PBS, also Antigen ohne Antikörper.
3. Stellen Sie alle 10 Röhrchen für 30 min. ins Wasserbad.
4. Protokollieren Sie , in welchem Gläschen eine Trübung auftritt und wie stark sie ist. ( - , + , ++ ....)
5. Zentrifugieren Sie die Präzipitate ab. (10 min. höchste Drehzahl)
6. Sie sollen den Proteingehalt des Präzipitats (Sediments) quantitativ bestimmen: Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab. Stellen Sie die Gläschen verkehrt herum für einen Moment auf ein Papierhandtuch, um auch Reste der Flüssigkeit mit abzusaugen.
7. Eigentlich müßte man das Präzipitat waschen, um wirklich exakte Ergebnisse zu erhalten (resuspendieren in PBS und nochmals zentrifugieren), wir verzichten auf diesen Schritt. Das Präzipitat wird in 2 ml n / 5ß NaOH gelöst.
8. Der Proteingehalt wird nach der Folin - Ciocalteu - Methode bestimmt: Ansatz in Reagenzgläsern.

2 ml Probe
+ 6 ml Na₂CO₃ Lösung (12,5%ig)
+ 1 ml CuSO₄ Lösung (0,1%ig )

60 min. stehenlassen (im Praktikum nur 30 min.), dann

1 ml Folin Reagenz hinzugeben

30 min. stehenlassen. Es bildet sich ein blauer Farbstoffkomplex. Für eine Eichkurve der Folin - Reaktion folgende Standardlösungen einsetzen
Eialbumin :

0,01 mg / 2 ml
0,1 mg / 2 ml
1,0 mg / 2 ml
2,0 mg / 2 ml

4,0 mg / 2 ml

Stammlösung entsprechend verdünnen.
10. Extinktionen bei lambda = 750 nm messen. Ergebnisse graphisch darstellen.

a ) Eichkurve
b ) Werte des Präzipitationstests

Sie erhalten Objektträger, die mit Agar beschichtet sind. In die Agarschicht sind 6 Löcher um ein zentrales Loch eingestanzt.

1. Geben Sie mit der Pasteurpipette einen Tropfen Antiserum in das zentrale Loch. Füllen Sie drei Löcher mit BSA und zwar

Nr. 1: unverdünnt
Nr. 3: 1 : 10 verdünnt

Nr. 5: 1 : 100 verdünnt

Die Löcher 2, 4 und 6 werden mit Eialbuminlösung gefüllt, ebenfalls verdünnt

Nr. 2: unverdünnt
Nr. 4: 1 : 10 verdünnt

Nr. 6: 1 : 100 verdünnt

2. Die 2. Platte wie folgt beschicken

Stellen Sie die Proben in einer feuchten Kammer in den Brutschrank (37°C). Die Auswertung erfolgt am folgenden Tage. Stellen Sie ein Diagramm her.

Was können Sie aus den Ergebnissen schließen?