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3.04. Alkoholdehydrogenase (ADH), Milchsäuredehydrogenase (LDH)
- Optischer Test - Enzymkinetik -

Filzschreiber (wasserunlöslich)
Sauerkraut
Buttermilch
Vollmilch

Zentrifuge
Glassachen und Diverses:
Gestell mit Reagenzgläsern
Gestell mit Zentrifugengläsern
4 Küvetten aus optischem Glas (d = 1,0 cm)
Pasteurpipetten mit Hütchen
Pipetten

5 ml
1 ml
0,1 ml

Pipettenbüchsen
Holzkasten zur Aufnahme von Pipettenbüchsen
Eisbehälter mit Eis
Kleenex - Tücher
Papierhandtücher
Parafilm, Glasstäbe
Becherglas (2 l, Plastik, für Abfälle)

Aqua dest. (Spritzflasche - grüne Markierung)
Aceton (Spritzflasche - rote Markierung)
Pyrophosphat - NaOH - Puffer (75 mM, pH 8,7)
Pyrophosphat - NaOH - Puffer (75 mM, pH 8,7), enthaltend: 75 mM Semicarbazid-HCl, 21 mM Glycin
NAD (24 mM)
Perchlorsäure (0.33 n)
ADH (kristallin) 30 mg / ml
Alkoholstandards

a) 0,5 mg Aethanol / ml (0,5%ig)
b) 1,0 mg Aethanol / ml (1,0%ig)
c) 2.0 mg Aethanol / ml (2,0%ig)
d) 3,0 mg Aethanol / ml (3,0%ig)

Analysenprobe : Alkohol im Blut (Rinderblut) ausgegebene Proben: A, B, C und D
LDH (kristallin) 10 mg /ml
NADH₂ (1,4 mM)
Na - pyruvat (35 mM)
Na - lactat (35 mM)
Triäthanolaminpuffer (0,1 m, pH 7,5)
Glycin - NaOH - Puffer (0.5 m, pH 9,0)
Glycin - NaOH - Puffer (0.5 m, pH 9,0), enthaltend 0,4 m Hydrazinhydroxyd

ZEISS - Spektralphotometer PM 2A
Pipettenstutzen, Wannen: zur Aufnahme gebrauchter Glassachen

Beide arbeiten mit NAD⁺ als Coenzym. Die Absorptionsspektren von NAD⁺ und von NADH + H⁺ sind in der Abbildung wiedergegeben. Die Reduktion des NAD⁺ und die Reoxydation des NADH + H⁺ zu NAD⁺ ist somit sehr leicht quantitativ zu verfolgen. Dieses Verfanren ist von WARBURG und CHRISTIAN entwickelt worden und ist als Optischer Test bekannt.
Sie werden heute mit einem bereits recht aufwendigen (und teuren) Spektralphotometer arbeiten, denn Sie haben Extinktionsänderungen bei lambda = 340 nm zu messen, und das können die Ihnen bekannten BECKMAN - Lehrspektralphotometer nicht mehr leisten. Sie werden Präzisionsküvetten aus optischem Glas verwenden. Ihre Schichtdicke beträgt genau 1,00 cm - der Preis ist entsprechend. Bei lambda = 340 nm kann man gerade noch mit einer Wolframlampe als Lichtquelle arbeiten und: die Durchlässigkeit des optischen Glases (75% des Lichts) ist noch ausreichend. Bei noch kürzeren Lichtwellenlängen müßte man eine Wasserstofflampe als Lichtquelle verwenden und die Küvetten müssten aus Quarzglas bestehen ( .. und die sind etwa 10 mal so teuer, wie die aus Glas ).

Die ADH katalysiert die Reaktion

C₂H₅OH + NAD⁺ < > CH₃CHO + NADH + H⁺

Das Gleichgewicht der Reaktion liegt auf der Seite von Äthanol und NAD⁺. Es kann jedoch durch NAD - Überschuß, alkalisches Milieu und Abfangen von Acetaldehyd durch Semicarbazid völlig auf die Seite von Acetaldehyd und NADH + H⁺ verschoben werden.

R-CHO + H₂N-NH-CO-NH₂ > R-CH=N-NH-CO-NH₂ + H₂O

Aldehyd + Semicarbazid > Semicarbazon + H₂O

Unter diesen Bedingungen ist die gebildete NADH + H⁺ Menge äquivalent zur Äthanol- Menge. Wir werden die ADH - Reaktion im Praktikum nur zur Bestimmung von Äthanolmengen einsetzen. Gleichzeitig sollen Sie sich aber die Enzymkinetiken Umsatzrate als Funktion der Substratmenge ansehen.

Das Enzym katalysiert die Reaktion

Pyruvat + NADH + H⁺ > Lactat + NAD⁺

Das Gleichgewicht liegt weit auf der Seite Lactat und NAD⁺. Aber auch hier läßt sich durch das alkalische Milieu und Abfangen des gebildeten Pyruvats mit Hydrazin das Gleichgewicht auf die Seite von Pyruvat und NADH + H⁺ verschieben. Sie haben die Aktivität der LDH bereits am vergangenen Nachmittag in der Buttermilchprobe nachgewiesen. Dort diente Methylenblau als Protonenakzeptor.
Die LDH ist weit verbreitet, z. B. in Milchsäurebakterien ( > Sauerwerden der Milch; Bildung von Sauerkraut - Sie werden das Experiment in der kommenden Woche durchführen).
LDH ist auch in vielen tierischen Geweben enthalten. Das Enzym ist in der biologischen Grundlagenforschung bekannt geworden, weil es das bestuntersuchte Enzym in Bezug auf Isoenzyme ist. Wir werden diese Problematik experimentell in einem der Fortgeschrittenenpraktika untersuchen. Heute sollen Sie die Aktivität des Enzyms als Funktion der Substratkenzentration untersuchen. Darüberhinaus sollen Sie die Lactatkonzentration in Blut, in Buttermilch, Vollmilch und im Sauerkraut bestimmen. LDH- Aktivitäten werden wir im Rinderserum suchen. Welche Schwierigkeiten würden Sie bei dem Versuch, die Aktivität in Milch oder Sauerkrautextrakt nachzuweisen, erwarten ?

Enzyme, NAD⁺, NADH + H⁺ sind stets in Eis aufzuheben. Pipettieren Sie in 10 ml Zentrifugengläser

gut mischen. Niederschlag in Probe mit einem Glasstab fein verteilen, dann 5 min. bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren, Überstand abgießen, je 0,1 ml vom Überstand, bzw. von verdünnten Standardlösungen zur Bestimmung einsetzen.
Test: In je ein Reagenzglas pipettieren

Zugabe des Enzyms bedeutet Start der Reaktion.
Bevor Sie das tun, sprechen Sie sich mit Ihrer Nachbargruppe ab, ob Sie das Spektralphotometer belegen können. Sie brauchen es dann ca. 20 - 25 min. ununterbrochen. Leihen Sie sich von der Nachbargruppe deren 4 Küvetten, so daß Sie insgesamt 8 zur Verfügung haben. Wenn das klar ist, mischen Sie die Probe und füllen Sie sie sofort in eine Küvette um.
Stellen Sie die Extinktion des Leerwerts auf 0 und beginnen Sie unmittelbar danach mit den Extinktionsmessunge aller Proben. Messen Sie die Proben in 1 minütigen Abständen durch, d. h. Sie müssen sehr schnell arbeiten, aber zu dritt geht es ganz gut. Überprüfen Sie zu jedem Zeitmeßpunkt den Blindwert am Meßgerät. Nach Abschluß der Meßserie: Auswaschen der Küvette

Ausspritzen mit Aqua dest.
mit Aceton.

Küvetten nur an den Seiten anfassen. Optische Flächen vorsichtig mit Kleenex - Tuch abwischen. Erst wenn die Küvetten wieder sauber und trocken sind, dürfen sie wieder verwendet werden.
Achtung: Alle Probenreste müssen mit Aqua dest. herausgespült sein, bevor Sie die Küvette mit Aceton ausspritzen (letzeres dient dazu, die Küvette schnell zu trocknen). Proteinreste aus der Probe präzipitieren mit dem Aceton und bleiben am Glas der Küvette hängen. Sie sind dann nur noch mit großem Aufwand - waschen mit Chromschwefelsäure - zu entfernen. Eine verunreinigte Küvette steht somit am Praktikumsnachmittag nicht mehr zur Verfügung.

1. Tragen Sie die Bildung des NADH + H⁺ gegen die Zeit auf.
2. Stellen Sie aus den Werten, die Sie für die Standards gemessen haben, eine Eichkurve auf.
3. Wieviel % -Alkohol können Sie im Blut des Rinds nachweisen ?
4. Tragen Sie die Umsatzrate (Steigung in Darstellung !) gegen die Alkoholkonzentration auf.

Füllen Sie direkt in die Küvette:

* Enzym bedeutet: Ausgangskonzentration : 10 mg / ml verdünnt mit Triäthanolaminpuffer:


1. 1 : 100
2. 1 : 1000

(Untersuchen Sie, bei welcher Verdünnung Sie die besten Werte erhalten).

Messen Sie die Extinktionen aller 5 Proben. Die Extinktion soll sich über einen Zeitraum von 5 min. nicht ändern. Erst dann können Sie die eigentliche Reaktion durch Zugabe von je 0,1 ml Pyruvat starten. Messen Sie die Extinktiosänderung als f (t). Ein Meßpunkt pro min. Dauer des Versuchs: ca. 20 min.

Umsatz als Funktion der Zeit und der Enzymkonzentration.
LDH im Blutserum. Stellen Sie Serum aus Blut her und verdünnen Sie es 1 : 1 mit Triäthanolaminpuffer.

1. Setzen Sie davon die gleichen Volumina für den Test ein, wie Enzymvolumina im letzten Versuch. Vergessen Sie die Vorinkubation nicht.
2. Wiederholung des Versuchs mit der doppelten Menge NADH + H⁺. .Achtung: die Extinktion ist hier >1.0. Schalten Sie am Spektralphotometer den Verstärkerknopf auf 10x, das bedeutet dann, daß Sie zu allen Meßwerten E = 1.0 hinzuzählen müssen. Schalten Sie zurück auf 1, sobald der Extinktionawert unter 1 absinkt .

Die Proben, in denen Sie Lactat nachweisen sollen, müssen zunächst enteiweißt werden.
In ein Zentrifugenglas pipettieren:

Perchlorsäure: 4,0 ml
Probe 2,0 ml

Zentrifugieren : wie beim Alkoholtest.
Bestimmungsansatz:

Bestimmen Sie auch hier die Reaktionskinetik. Worin unterscheidet sie sich von der des Pyruvatansatzes ?

Um Bezugspunkte zu erhalten, brauchen Sie natürlich auch hier eine Eichkurve.
Setzen Sie dafür ein

0,05; 0,1; 0,2; 0,4 ml der bereitstehenden Lactatlösung. Das ergibt dann folgenden Ansatz:

Brechen Sie die Extinktionsmessungen nach spätestens 25 min. ab.

Graphische Darstellung der Ergebnisse wie bei der ADH - Auswertung