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Zitronen
Apfelsinen
Weißkohl
Ananas (in Dosen)
Orangensaft
Hefe
Sauerkraut
Filzschreiber (wasserunlöslich)
Messer zum Zerkleinern von Spinatblättern, Zitrone, Kohl etc

Zentrifuge
Bürette (50 ml) (blaue Markierung)
Bürette (10 ml) (gelbe Markierung)
Stativ mit Bürettenklammer
Bürolampe mit 100 Watt Birne
Heizplatte (Magnetrührer)
pH- Meter mit Glaselektrode
Molekülbaukasten (Modelle)

Eisbehälter mit Eis
Mörser mit Pistill (vorgekühlt - Ausgabe auf Anfrage, unmittelbar vor Versuchsbeginn)
Alu - Folie
Gestell mit Zentrifugengläsern (vorgekühlt - Ausgabe auf Anfrage, vor Versuchsbeginn)
Holzbrett
Gestell mit Reagenzgläsern
Gaze (Mull: 4 Lagen)
3 Trichter
Becherglas (100 ml, Glas) vorgekühlt
4 Erlenmeyer (100 ml)
4 Versuchsrohe aus Plexiglas mit Gumistopfen und Gärhahn
Pasteurpipetten mit Hütchen
Pipetten

5 ml
1 ml

Pipettenbüchsen
Holzkasten zur Aufnahme der Pipettenbüchsen
Kleenex - Tücher
Papierhandtücher
Parafilm
4 Bechergläser (50 ml)
4 Bechergläser (100 ml)
Gestell mit Reagenzgläsern
2 Meßzylinder (250 ml)
Becherglas (400 ml)
Becherglas (2 l, Plastik, für Abfälle)
2 Trichter
Spinatblätter
Sprosse eines Wasserfarns (Ceratopteris thalictroides)

10 g Seesand (vorgekühlt im Mörser)
Isolationsmedium: Herstellung : 0,5 m K- Phosphatpuffer pH 8.0: 20 ml; 0,5 m Saccharose 50 ml, EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure): 0,1 m, 1 ml; NaCl 5 m, 0,2 ml;. mit 2 n KOH auf pH 8.0 titrieren; mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen.
Reaktionsmedium: Herstellung : 0,5 m K- Phosphatpuffer pH 6,5, 2o ml ; 0,5 m Saccharose 50 ml; mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen.
Aqua dest. (Spritzflasche)
2, 6 - Dichlorophenolindophenol (DCPIP) (1 mg/ml)
Methylenblau (0.02%ig)
Na₂S₂O₄ (3%ig) frisch angesetzt
Gelatine (0,3%ig )
Paraffin (flüssig)
pro Gruppe 4 der nachfolgend genannten Kohlenhydrate

Glucose (5%ig)
Fructose (5%ig)
Saccharose (5%ig)
Lactose (5%ig)
Galactose (5%ig)
Mannose (5%ig)
Mannit (5%ig)
Maltose (5%ig)
Stärke (2%ig)
Dihydroxyaceton (5%ig)

NaOH (n / 50)
Phenolphthalein (1%ige alkoholische Lösung)
NaCl (fest)
Metaphosphorsäure (HPO₃: 3%ig)
2, 6 Dichlorophenolindophenol (DCPIP) (1 mM = 326 mg / l)
Askorbinsäure (1 mM; gelöst in 3%iger HPO₃ (= 176,13 mg / l)
Citratpuffer, pH 2,0 (200 mg / ml Citronensäure + 90 mg /.ml Na₂HPO₄ x 12 H₂O)
NaOH (n /10)
pH- Papier

Wasserbad, eingestellt auf 37°C
Brutschrank, eingestellt auf 37° C
Stativ mit Halterungen für die Plexiglas-Versuchsrohre
Versuchseinrichtung zur Messung der Milchsäuregärung
Pipettenstutzen, Wannen: zur Ablage gebrauchter Glassachen

Einige historische Daten

S. HALES (1677 - 1761); engl. Botaniker, erkannte, daß ein Bestandteil der Luft für die Ernährung der grünen Pflanzen erforderlich ist.
J. PRIESTLEY (1733 - 1804) entdeckte die "Verbesserung der Luft" durch grüne Pflanzen. ( > Sauerstoffentwicklung)
J. INGENHOUSZ (1730 - 1799) entdeckte die Rolle des Lichts bei der Photosynthese.
J. SENEBIER (1742 - 1809 ): Abhängigkeit der Photosynthese vom Kohlendioxyd.
N. T. SAUSSURE (1767 - 1845): Einbau von Wasser in die organische Substanz von Pflanzen.
T. W. ENGELMANN (1843 - 1909) wies 1883-85 experimentell die Wellenlängenabhängigkeit der Photosynthese nach.

1923 postulierte THUNBERG, daß bei der Photosynthese "aktiver Wasserstoff" aus Wasser gebildet wüirde.

Den experimentellen Beweis erbrachte 1937 HILL, der zeigen konnte, daß Chloroplasten bei Belichtung die folgende Reaktion katalysieren

H₂O + A >> Licht, Chloroplasten >> AH₂ + ½ O₂

A ist hier eine reduzierbare Substanz. HILL verwendete Fe^III als A.

H₂O + 2 Fe^III > > Licht, Chloroplasten > > 2 Fe^II + ½ O₂ + 2 H⁺

Statt des Fe^III kann man auch andere Komponenten, wie z. B. reduzierbare Farbstoffe, verwenden. Das hat den Vorteil, daß man einen klaren Farbumschlagspunkt erkennen kann. Hierzu eignet sich z.B. sehr gut das 2, 6 Dichlorophenolindophenol. Auch wir werden es im Praktikum verwenden.

Die HILL- Reaktion hat zwei Gemeinsamkeiten mit der Photosynthese

1. Die Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie
2. Die Bildung von molekularem Sauerstoff.

Die Primärreaktion bei der HILL- Reaktion und der Photosynthese ist die photolytische Spaltung des Wassers

4 H₂O > 4 H⁺ + 4 OH^-

Bei der Photosynthese wird im Anschluß daran CO₂ reduziert, es entstehen Kohlenhydrate.: (CALVIN Cyklus)
Durch Verwendung von ¹⁸H₂O konnte gezeigt werden, daß der freiwerdende Sauerstoff tatsächlich aus dem H₂O, nicht aus dem CO₂ stammt. Auch photosynthetisierende Bakterien können, wie die grünen Pflanzen, CO₂ zu Kohlenhydraten reduzieren. Es entsteht dabei aber niemals freier Sauerstoff. Die Photosynthese hängt dort von der Anwesenheit reduzierender Substanzen (z. B. H₂S, H₂ u.a.) ab. Zurück zur Photosynthese grüner Pflanzen Während bei der HILL- Reaktion die Protonen vom Farbstoff aufgenomen werden, ist bei grünen Pflanzen NADP der Waaserstoffakzeptor.

Im Praktikum werden Sie außer der HILL- Reaktion die Produktion von O₂ durch grüne Pflanzen nachweisen. Aus praktischen Gründen arbeitet man hier mit Wasserpflanzen. Man kann natürlich das bei der Photosynthese entstehende Gas auffangen und anschließend als O₂ nachweisen. Ein wesentlich empfindlicherer Nachweis jedoch ist die Oxydation eines reduzierten Farbstoffs. Wir verwenden hierfür mit Na₂S₂O₄ reduziertes Methylenblau:

E'₀ für Methylenblau ox / red. : 0,01 V
E'₀ für 2, 6 DCPIP ox / red.: + 0,22 V

2,6 DCPIP ist somit nicht so leicht reoxydierbar, wie das red. Methylenblau. Red. Methylenblau oxydiert auch beim Stehenlassen an der Luft (Autoxydation).

Sie erhalten im Praktikum eine Reihe von Kohlenhydraten und sollen entscheiden, welche von Hefe vergärt werden können. Es sollte sich ja inzwischen herumgesprochen haben, daß bei der alkoholischen Gärung durch Hefe Aethanol entsteht, so daß wir auf einen weiteren Nachweis verzichten können. Es entsteht aber auch CO₂, welches mit Phenolphthalein gefärbte NaOH entfärbt. Die Zeit bis zum Farbumschlag ist in grober Annäherung ein quantitatives Maß für die Vergärbarkeit des Substrats (> Fermentation des Substrats). Sie finden am Arbeitsplatz einen Satz Molekülmodelle. Quiz: Um welche Moleküle handelt es sich dabei? Welche der nachfolgend genannten Alternativen treffen zu?

D, L - Formen
alpha, beta - Stellung der Hydroxylgruppe
alpha, beta - glykosidische Bindung usw.

Versuchen Sie, Sauerkraut herzustellen. Es wird einige Wochen dauern. Wie Sie bereits am letzten Nachmittag gesehen haben, beruht der saure Geschmack auf der Anwesenheit von Lactat (Milchsäure). Produziert wird sie von Milchsäurebakterien (Gattung : Lactobacillus). Nach 14 Tagen können Sie eine Probe entnehmen und die Bakterien mikroskopisch nachweisen. Vom letzten Nachmittag wissen Sie ja noch, wie man LDH und Lactat nachweist - an dieser Stelle verzichten wir auf einen Nachweis von Enzym und seinem Produkt.

In der Anleitung zur Herstellung der Chloroplasten für die HILL- Reaktion steht, daß die Chloroplasten einmal gewaschen werden müssen. Wenn Sie auf dieses Waschen verzichten, laufen Sie Gefahr, daß die "HILL- Reaktion" auch ohne Lichteinfluß funktioniert - und damit wäre die unter Punkt (1.) gemachte Aussage in Frage gestellt. Ursache dieses scheinbaren Widerspruchs ist die Anwesenheit von Askorbinsäure (Vitamin C) im Pflanzenpressaft. Die Askorbinsäure kann 2,6 DCPIP ebenfalls reduzieren und deshalb müssen wir sie erst los sein, bevor wir eine hieb- und stichfeste Aussage aus dem HILL- Experiment erwarten können. Andererseits eignet sich das Entfärben des 2,6 -DCPIP, um die Konzentration von Askorbinsäure in Pflanzenpressäften, im Harn u.a. durch Titration zu bestimmen.

Da es in der Pflanzenzelle eine Reihe weiterer reduzierender Substanzen gibt, müssen auch die zuerst ausgeschaltet werden, bevor eine Titration der Askorbinsäure durchgeführt werden kann. Das läßt sich am einfachsten durch Zugabe von Metaphosphorsäure (HPO₃ erreichen. Die Reaktion wird also im stark Sauren durchgeführt. 2,6 DCPIP sieht in dem pH- Bereich rot aus, und nicht blau, wie im Alkalischen. (Der Farbstoff käme somit auch als pH- Indikator in Betracht). Die Stabilität des 2,6 DCPIP im Sauren ist jedoch nicht sehr hoch - das mag manche Aussagen quantitativer Natur beeinträchtigen.

Askorbinsäure ist in Pflanzen weit verbreitet, aber sie ist nicht allgegenwärtig. In der Regel liegt sie in der reduzierten Form vor. Durch Luftsauerstoff in Gegenwart von Schwermetallspuren wird sie irreversibel oxydiert, besonders in alkalischer Lösung. Im Sauren ist sie ziemlich beständig. Es ist gezeigt worden, daß Askorbinsäure bei einer Reihe von Redox- Vorgängen in der Zelle beteiligt ist, z. B. bei der Oxydation reduzierter Pyridinnukleotide und von Glutathion.

Der Askorbinsäuregehalt von Pflanzen, die im Licht aufwachsen, ist wesentlich höher als in ethiolierten Pflanzen (>Aufzucht im Dunklen). Nicht die Photosyntheseaktivität, sondern das Phytochromsystem ist für den erhöhten Gehalt in belichteten Pflanzen verantwortlich. Vitamin C ist für den Menschen und einige Tierarten Primaten, Meerschweinchen ...) unentbehrlich und muß mit der Nahrung aufgenommen werden, während Hund, Kaninchen Ratte, Maus und warscheinlich auch die Wiederkäuer es selbst bilden können. Über Mangel an Vitamin C ist zuerst von Seefahrern berichtet worden (Scorbut). Die ersten zuverlässigen Berichte stamen aus dem 13. Jahrhundert (Zeit der Kreuzzüge). Im 15. und 16. Jahrhundert war Scorbut eines der größten Hindernisse der Seefahrt. Bei der Umsegelung des Kaps der Guten Hoffnung durch VASCO da GAMA erlagen von 160 Mann Schiffsbesatzung 100 dem Scorbut. Heilung des Scorbuts ist nur durch geeignete Nahrung möglich. Die wichtigsten Publikationen hierzu:

1734 BACHSTROM: ,,Observationes circa scorbutum; eiusque indolem, causa, signa et curam".
1757 LIND: ,,A treatise on scurvey" experimentell beim Meerschweinchen..

Der antiscorbutisch wirksame Stoff erhielt die Bezeichnung : Vitamin C.
Vitamin-C- Mangel führt zur Schädigung des Endothels von Blutkapillaren. Folge: Blutungen in zahlreichen Geweben (Haut, in Schleimhäuten, den Gelenken, Entzündung und Schwellung des Zahnfleisches ...) Während der Embryonalentwicklung führt Mangel zu schweren Störungen der Knochenbildung. Die Neubildung von Knochengewebe hört auf. Da die Abbauvorgänge weitergehen, tritt ein starker Schwund der Knochensubstanz ein. Vitamin C scheint ganz allgemein für die Bildung von interzellulärer Substanz von Bedeutung zu sein.

Ihnen ist es sicher geläufig, daß Fruchtsäfte sauer schmecken. Um sich eine Vorstellung davon zu machen, wieviel Säure enthalten ist, sollen Sie eine Titration mit n / 10 NaOH durchführen. Unabhängig davon bestimmen Sie den pH- Wert. Können Sie aus dem Verbrauch an n / 10 NaOH auf den pH- Wert schließen?
Begründen Sie Ihre Entscheidung.

Es ist zügig zu arbeiten Alle Ansätze kalt stellen (im Eisbad) Wenn Sie sich entschlossen haben, anzufangen, lassen Sie sich die Materialien geben. Sie sind bei -15°C vorgekühlt worden.
10 g Blätter (Spinat) werden mit 10 g Seesand (bereits abgewogen und vorgekühlt) und 20 ml Isolationspuffer im Mörser (auf Eis) homogenisiert. Der Pflanzenbrei wird durch Mull in ein vorgekühltes Becherglas gepresst. Der Mull sollte mit Isolationsmedium getränkt sein. Das Filtrat wird einer differentiellen Zentrifugation unterworfen

1. 10 min. bei 500 g (= 75% der Leistung der Laborzentrifuge). Das Sediment wird verworfen. Der Überstand wird in ein neues Zentrifugenglas überführt und
2. 10 min. bei 1000 g (= 90% der Leistung der Laborzentrifuge) zentrifugiert. Das Sediment wird in 10 ml Isolationsmedium resuspendiert.

Diese Chloroplastensuspension kann für die HILLReaktion verwendet werden. Zwei Parallelansätze in Reagenzgläsern (eines lichtdicht mit Alufohe umwickeln)

9 ml Reaktionsmedium
1 ml Suspension
0,05 ml 2, 6 DCPIP (1 mg / ml)

Protokollieren Sie die Farbe Ihrer Probe. Beleuchten Sie beide Proben (in einem Becherglas mit Wasser) mit einer 100 Watt Birne. Das Wasserbad dient hier als - notwendiges - Wärmeschutzfilter, denn die Lampe heizt ihre nähere Umgebung merklich auf.

Wie lange dauert es, bis in der belichteten Probe eine Entfärbung auftritt?

Wie sieht zu dem Zeitpunkt die unbelichtete Probe aus? Geben Sie nach Entfärbung des 2, 6 DCPIP nochmals 0,5 ml davon dazu - Sie können auf diese Weise testen, wie lange Ihre Chloroplasten unter diesen Bedingungen noch aktiv bleiben.
Wenn Sie noch einen Rest des unzentrifugierten Filtrats übrig haben, geben Sie dazu etwas 2, 6 DCPIP und halten Sie den Ansatz dunkel. (Wenn bei Dunkelheit eine Entfärbung auftritt, beruht sie auf dem Vitamin C-Gehalt des Pressafts).

In 3 100 ml Erlenmeyer werden gegeben

70 ml Wasser
30 ml Gelatinelösung (0,3%ig)
3 ml Methylenblau (0,02%ig)

Entfärben Sie die blaue Lösung durch Zugabe von einigen Tropfen (5 - 8) Na₂S₂O₄ - Lösung (3%ig, frisch angesetzt). Wenn das Methylenblau entfärbt ist, geben Sie zur Sicherheit noch einen weiteren Tropfen Na₂S₂O₄ hinzu (aber nicht mehr !)

Umwickeln Sie einen der Erlenmeyer lichtdicht mit Alufohe. Geben Sie in diesen und einen zweiten Erlenmeyer einige Zweige von Ceratopteris thalictroides (einem Wasserfarn) und verschließen Sie den Erlenmeyer luftdicht mit einigen ml flüssigem Paraffin (zur Verhinderung der Autoxydatiozn des Methylenblaus). Belichten Sie die Proben mit der 100 Watt - Birne. Was geschieht ?

Kochen Sie einige der Ceratopteris - Zweige auf und testen Sie die photosynthetische Aktivität dieser abgekochten Pflanzenteile.

Testen Sie die Vergärbarkeit von 4 der bereitstehenden 5%igen Kohlenhydratlösungen. Vergleichen Sie Ihre Ergebnisse mit denen der Nachbargruppen, damit Sie ein vollständiges Bild über die Vergärbarkeit aller zur Verfügung gestellten Substrate erhalten.
Füllen Sie je ein Versuchsrohr mit 90 ml der Lösung, geben Sie je 10 ml einer 20%igen wässrigen Hefesuspension hinzu (vorher herstellen). Schließen Sie anschließend das Versuchsrohr mit dem Gäraufsatz (Gärhahn). Füllen Sie den Gäraufsatz mit n / 50 NaOH und einigen Tropfen Phenolphthal ein. Stellen Sie den Reaktionsansatz in das 37°C Wasserbad und beobachten Sie, wann was geschieht. Der Versuch sollte über 2 Tage hinweg verfolgt werden.

Zerkleinern Sie 1 / 4 eines Kohlkopfs. Füllen Sie das Versuchsrohr der ,,Gärapparatur" 3 cm hoch mit zerkleinertem Kohl, darauf kommt festes NaCl (ca. 1 mm Schicht). Sehr wichtig: alles so fest stampfen (mit bereitliegendem Holzstock), wie es nur geht, dann alternativ wieder eine Schicht Kohl, eine Schicht Salz usw. Wenn das Rohr nahezu voll ist, sollte eine Flüssigkeitslake über der Kohl - Salz- Säule stehen. Es ist wichtig, daß der Kohl nicht mit Luft in Kontakt kommt. Stecken Sie anschließend das Thermometer in die Flüssigkeit. Das Ableitrohr und der Kolben (Spritze) dient dem Auffangen von sich bildendem CO₂.
Beobachten Sie die Temperatur alle paar Tage. Der Versuchsansatz soll mindestens 4 Wochen stehenbleiben. Den Versuchserfolg kann jeder durch eine Geschmacksprobe testen.
Warum dauert dieses Verfahren so viel länger, als die vorhin angesetzte Alkoholische Gärung?

1. Füllen der 10 ml Bürette mit 2, 6 DCPIP (1 mM). Achten Sie auf die Konzentrationsangabe

2. Titration der 1 mM Ascorbinsäure. Vorlage (in 50 ml Becherglas): 0, 1, 2, 3, 4 ,5 ml. Wieviel 2,6 DCPIP wird verbraucht ? Eichkurve aufstellen. Achtung: Der Titrationsendpunkt ist erreicht, sobald in der Vorlage eine Rosafärbung auftritt, die mindestens 30 sec. erhalten bleibt.

3. Pressäfte von Früchten werden 1 : 10 mit 3%iger HPO₃ verdünnt. Nehmen Sie davon je einige ml als Vorlage für die Titration. Bestimmen Sie selbst, wieviel Sie vorlegen müssen, um einen sinnvollen Meßwert zu erhalten. Bestimmen Sie den Askorbinsäuregehalt in den Ihnen vorliegenden Extrakten

4. Kochen Sie einige ml Orangensaft auf. Prüfen Sie anschließend den Askorbinsäuregehalt und vergleichen Sie ihn mit dem Gehalt der nicht gekochten Probe

Enthält Weißkohl Askorbinsäure?

Bestimmen Sie den pH- Wert der unverdünnten Fruchtsäfte

mit dem pH- Meter
mit pH- Papier

Kommen Sie zum gleichen Ergebnis?

Titrieren Sie die Fruchtsäfte mit n / 10 NaOH (50 ml Bürette verwenden). Vorlage: 5 - 10 ml ( ausprobieren !). Auswertung: s.. theoretischen Teil.