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Objektträger
Deckgläser
ein Stück Leber (frisch)
Blätter einer grünen Pflanze

Mikroskop
Becherglas mit Wasser
Pasteurpipetten mit Hütchen
Belüftungsanlage
Gestell mit Reagenzgläsern
2 Uhrschälchen
Mörser und Pistill
Gaze (Mull)
Trichter
Erlenmeyer (100 ml)
Becherglas (2 l, Plastik, für Abfälle)
Kleenex - Tücher
Papierhandtücher
Parafilm

0,001% ige Lösung von Janusgrün B (0,001%ig) in 5% Saccharose
Na₂S₂O₄ (3%ig)
Neutralrot (0.1%ige Lösung)

Dieser letzte Praktikumsnachmittag des Stoffwechselphysiologischen Teils der Biologischen Übungen III dient dazu, Ihnen verständlich zu machen, daß bestimte Reaktionen an größere Strukturen gebunden sind. Dieses Phänomen haben Sie bereits bei der O₂ - Anlagerung an Hänim kennengelernt; freies Hämin bindet keinen Sauerstoff, an Globin gebundenes Hämin ist dazu in der Lage. Die HILL - Reaktion läuft an isolierten Chloroplasten ab. Wir haben es nicht versucht, sie mit reinem Chlorophyll zu initiieren. Der Versuch wäre danebengegangen. In den Chloroplasten ist das Chlorophyll membrangebunden und nur membrangebundenes Chlorophyll ist aktiv.

Mitochondrien

Analoges gilt für die Reaktionen der Atmungskette. Der Elektronentransport und die Oxydative Phosphorylierung spielen sich an der inneren der Mitochondrienmembran ab. Mitochondrien können durch Janusgrtin B - einem Derivat des Safranins spezifisch angefärbt werden. Janusgrün B ist ein sogenannter Vitalfarbstoff, d.h. die gefärbten Strukturen bleiben nach wie vor funktionsfähig; aber, so ganz unschädlich ist Janusgrün B auch wiederum nicht - Sie werden es schon sehen. Janusgrün B ist reduzierbar. Es entsteht zunächst Safranin und bei weiterer Zugabe des reduktionsmittels (z. B. Na₂S₂O₄) die reduzierte Form des Safranins. Jene ist durch Luftzufuhr wieder in Safranin überführbar - aber Janusgrün B bleibt irreversibel zerstört.

Es gelten die Regeln für das Mikroskopieren, so wie in den Biologischen Übungen I erprobt.

ziehen Sie ein Stück Epidermis von einem der mitgebrachten Blätter ab. Überführen Sie es auf einen Objektträger, decken Sie es mit dem Deckglas ab und betrachten Sie den Zellverband unter dem Mikroskop. Zum Wiederholen

erinnern Sie sich an die charakteristische Form der Epidermiszellen?
enthalten sie Chloroplasten?
Wie sehen Spaltöffungen aus?

Wenn Sie mit allem wieder vertraut sind, saugen Sie einen Tropfen der 0,001%igen Janusgrün B - Lösung durch Ihr Präparat.

Wie lange dauert es, bis sich irgendetwas verfärbt ?

Mitochondrien können Sie bei 400facher Vergrößerung nur mit Mühe erkennen. Bei 1000facher Vergrößerung (Ölimmersion) erhält man ein befriedigendes Bild.

Welche Strukturen haben sich gefärbt?
Bleibt die Farbe, bleibt die Form erhalten?

b) Mitochondrien in Leberzellen

Kleines Stück Leber mit einigen ml (5 - 10) Phosphatpuffer homogenisieren. Homogenat durch Gaze filtrieren, anschließend mikroskopieren. Färbung mit Janusgrün B, wie bei dem pflanzlichen Objekt.

c) Reduktion von Janusgrün B, abschließende Oxydation zu Safranin.

Zu einigen Millilitern Janusgrün B tropfenweise Na₂S₂O₄ hinzugeben.

Welche Farbumschläge sind erkennbar?

Blasen Sie anschließend mit Hilfe der Belüftungsanlage Luft durch die Probe. Wie verändert sie sich?

d) Färben Sie ein Präparat der pflanzlichen Epidermis und eine Leberzellensuspension mit Neutralrot.

Neutralrot ist ein pH - Indikator.

Wie färben sich die einzelnen Bereiche der Zellen?

Entnehmen Sie Ihrem Sauerkrautansatz einige Milliliter Flüssigkeit.

Können Sie darin mikroskopisch Bakterien nachweisen? (400fache Vergrößerung, Phasenkontrast)
Welche Form haben Sie?