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3.01. Löslichkeit, Hydrathülle, Titrationen, Isolierung und Kristallisation eines Naturprodukts.

Filzschreiber (wasserunlöslich !)

Geräte:

pH- Meter mit Glaselektrode
Magnetrührer mit Heizplatte
2 Magnetkerne
Hebebühne
2 Büretten (Inhalt: 50 ml)
Stativ mit Bürettenklammer
Wasserstrahlpumpe mit Druckschlauch
Zentrifuge

Pipetten: 5 ml
Pipettenbüchsen
Holzkasten zur Aufnahme der Pipettenbüchsen
Pasteurpipetten mit Hütchen
Gestell mit Reagenzgläsern
6 Zentrifugengläser
Gestell für Zentrifugengläser
2 Erlenmeyer (300 ml)
Saugflasche
Nutsche
1 Satz Dichtungsringe
Filter
Schutzbrille
Metallspatel
Probenröhrchen mit Stopfen
Thermometer
2 Trichter
Kleenex - Tücher
Papierhandtücher
Parafilm

1n NaOH
1n HCl
0,1n Glycin (ausgegeben als Analsenprobe A, B oder C)
0,1n Arginin (ausgegeben als Analysenprobe A, B oder C)
0,1n Glutaminsäure (ausgegeben als Analysenprobe A, B oder C)
Gelatinelösung (10%ig in physiol. NaCl)
Eialbuminlösung (10%ig in physiol. NaCl)
physiol. NaCl (= 0,9%ig) und gesättigte NaCl - Lösung
Rinderblut
Aqua dest. (Spritzflasche - grüne Markierung)
(NH₄)₂SO₄: gesättigte Lösung
HgCl₂: gesättigte Lösung
Aethanol (vergällt)
Trichloressigsäure (TCA): 10%ige Lösung
Eisessig (Essigsäure)
Harnstoff: gesättigte Lösung

Brutschränke
Pipettenstutzen (zur Aufnahme gebrauchter Glassachen)
Wannen (zur Aufnahme gebrauchter Glassachen)

Die Reaktionen in einer Zelle spielen sich entweder in wässriger Lösung oder an spezifischen Oberflächen ab. Am heutigen Versuchsnachmittag werden wir uns vor allem mit der ersten Alternative befassen. In Wasser lösen sich nur solche Stoffe, die dissozierbare (ionisierbare) Gruppen enthalten.

Wasser hat eine sehr hohe Dielektrizitätskonstante (80 bei Zimmertemperatur), das bedeutet, daß sich zwei elektrische Ladungen mit entgegengesetztem Vorzeichen im Wasser nur mit 1 / 80 der Kraft anziehen, die sie in Luft (oder im Vakuum) aufeinander ausüben. Daraus folgt, daß die Ionen, etwa eines Natriumchloridkristalls erheblich leichter abdissozieren können als an Luft, weil ja die Kraft, die das Ion zur Kristalloberfläche zurückzieht, im Wasser nur 1 / 80 so stark ist wie an der Luft. Es genügt somit die thermische Anregung bei Zimmertemperatur, um die relativ schwache Anziehungskraft der Ionen im Kristall zu überwinden und die Ionen in großer Zahl ins wässrige Medium abdissozieren zu lassen. Man erhält somit eine recht konzentrierte Salzlösung. Wasser ist als Reaktionspartner an einer Vielzahl chemischer Umsetzungen beteiligt. Wassermoleküle haben die Tendenz, sich mit Ionen zu hydratisierten Ionen zu verbinden. Diese Tendenz geht auf das große elektrische Dipolmoment des Wassers zurück.
Wassermoleküle haben somit Ionencharakter (> ungleiche Ladungsverteilung im Molekül) Jedes negative Ion zieht die positiven Seiten benachbarter Wassermoleküle an. Es bilden sich daher Hydrathüllen aus. Die Bindungen zwischen einem Wassermolekül und einem benachbarten Molekül werden Wasserstoffbrücken genannt. Wasserstoffbrücken sind u.a. die Ursache für den hohen Siedepunkt des Wassers
Wasser ist dissozierbar

H₂O < > H⁺ + OH^-
H⁺ + H₂O < > H₃O⁺

In einem Liter Wasser findet man bei Zimmertemperatur

1 x 10^-7 mol H₃O⁺ ( Hydroniumionen )

und die gleiche Menge OH^- Ionen. Freie Protonen (H⁺) kommen im Wasser nicht vor. Genaugenommen ist auch das H₃O⁺ hydriert, so daß man H₉O₄+ erhält.
Die Dissoziation des Wassers kann man wie folgt schreiben:

K_w = [H⁺] [OH^-] / [ H₂O ]

K_w läßt sich aus der Leitfähigkeit des Wassers errechnen und man erhält als Dissoziationskonstante:

1,8 = 10^-16 mol / l

Diese Gleichung kann auch wie folgt geschrieben werden:

[H⁺ ] [OH^-] = K [ H₂O]

Daraus ergibt sich die Molarität des Wassers:

1000 / 18 = 55,5.

sowie das Ionenprodukt des Wassers. [H⁺][OH^-] kann somit wie folgt bestimmt werden:

1,8 x 10^-16 x 55,5 = 10^-14

wenn

[H⁺] = [OH^-] ,

dann ist

[H⁺]² = 10^-14

und

[H⁺] = 10^-7

Wasserstoffionen werden durch Dissoziation von Säuren frei. Die relativen Konzentrationen der [H⁺]- und [OH^-]- Ionen in einer wässrigen Lösung sind ein Maß für die Azidität (saure Wirkung) oder die Basizität (basische odor alkalische Wirkung) der Lösung. Die Reaktion einer Lösung wird in der Regel durch die Wasserstoffionenkonzentration definiert.

1909 führte SØRENSEN den Begriff pH ein. pH ist definiert als negativer dekadischer Logarithmus der [H⁺]

pH = log₁₀ 1 / [H⁺] = -log₁₀ [H⁺]

Folglich hat neutrales Wasser einen pH - Wert von 7,0. Ist der pH <7,0 hat man eine saure, ist der pH > 7,0 hat man eine basische (alkalische) Lösung vor sich. Es ist außerordentlich wichtig, sich im Klaren darüber zu sein, daß pH- Werte logarithmisch, nicht arithmetisch sind.
Die Differenz zwischen 2 pH - Werten (z.B. pH 6 und pH 7) bedeutet, daß bei pH 6 10x soviele Wasserstoffionen vorliegen, wie bei pH 7,0

BRÖNSTED und LOWRY haben Säure- Basen- Reaktionen in wässrigen Lösungen im Detail untersucht und haben einige allgemeingültige Regeln aufstellen können:

Eine Säure ist ein Protonendonor, eine Base ein Protonenakzeptor.

Jede Säure hat eine charakteristische Affinität zu Protonen. So bilden z.B. die Essigsäure (CH₃COOH) und das Acetatanion (CH₃COO^-) ein konjugiertes Säure - Basen - Paar. Säuren mit einer hohen Protonenaffinität bezeichnet man als schwache Säuren, die mit niedriger Affinität als starke Säuron. Der Dissoziationsgrad kann durch die Dissoziationskonstante (K) angegeben werden. Am Beispiel dor Essigsäure können wir die folgende Ableitung nachvollziehen:

K_E = [CH₃COO^-] [H⁺] / [CH₃COOH] = 1,8 x 10^-5

Der Wert liegt so niedrig, daß wir bei der Berechnung des pH-Werts die Konzentration dissoziierter Ionen vernachlässigen können. Die Konzentration der nicht dissoziierten Moleküle ist somit gleich der Konzentration der Säure. Wir können weiterhin davon ausgehen, daß

[H⁺] = [CH₃COO^-],

dann ist:

[H⁺]² = [CH₃COOH] x 1,8 x 10^-5 .

In einer 10^-1 molaren Säure beträgt die Wasserstoffionenkonzentration somit:

[H⁺] = Quadratwurzel 10^-1 x 1,8 x 10^-5

Der pH - wäre dann

pH = -log Quadratwurzel 1,8 x 10^-6

= - ½ log (1,8 x 10^-6)

= (- 0,2533 / 2) + 3

= 3 - 0,1277

= 2,87

Der pH- Wert einer schwachen Säure liegt weit über dem einer starken Säure, da bei einer starken Säure (etwa bei HCl) der Anteil dissoziierter H⁺ - Ionen gleich der eingesetzten Konzentration ( = Normalität) ist. Eine 1/10 n HCl hätte somit den pH:

= -log [HCl]

= -log 10^-1

= 1

Die Beziehung zwischen einer Dissoziationskonstanten (KS) und der molekularen Konzentration einer Säure [S] läßt sich angenähert durch folgende Gleichung wiedergeben:

pH = 1/2 log ( KS x [S] )

Oft ist die Dissoziationskonstante unbekannt. Umformulierung des beschriebenen Ansatzes führt zunächst einmal zur Berechnung des Dissoziationsgrades alpha. Hierzu benötigt man [ S ] und den pH- Wert alpha ist das Verhältnis der Menge dissoziierter Moleküle zur Gesamtzahl gelöster Moleküle der betreffenden Verbindung.

alpha = [H⁺] / [S] = 10^-pH / [S]

oder log alpha = -pH - ( + log [S] )

In allgemeinen Formulierungen wird für Säure oft die Abkürzung HA verwendet, somit ist:

k = [H⁺] [ A^-] / [HA] = [H⁺] x [A^-] / [HA]

Durch Logarithmieren kommt man zu

log k = log [H⁺] + log [ A^-] / [HA]

Ähnlich wie bei der Definition des pH kann man auch hier den negativen Logarithmus der Dissaoziationskonstanten als eine Größe - den pK- Wert - der dissoziierbaren Verbindung einsetzen:

pH = pK + log [A^-] / [HA]

Diese Beziehung ist als HENDERSON - HASSELBALCH-Gleichung bekannt. Nach ihr kann man [A^-] / [HA] gleich dem Dissoziationsgrad alpha setzen (siehe oben) Für eln Gemisch einer schwachen dissoziierten Säure mit einem ihrer voll dissoziierten Salze kann [A^-] gleich der Salzkonzentration und [HA| gleich der Gesamtsäurekonzentration gesetzt worden. Somit ist:

pH = pK + log [Salz] / [Säure]

Diese Form der HENDERSON - HASSELBALCH - Gleichung kann uns helfen, pH- Werte in Puffergemischen zu berechnen.

Mischungen schwacher Säuren (oder schwacher Basen) mit einem ihrer gut dissoziierten Salze sind gute Puffer.

Die HENDERSON - HASSELBALCH - Gleichung sagt aber auch aus, daß der pH- Wert gleich dem pK- Wert ist, wenn genau die Hälfte einer Verbindung dissoziiert ist, oder wie im letzten Beispiel, die Salzkonzentration gleich der Säurekonzentration ist. (da log 1 = 0). Puffer reagieren innerhalb gewisser Grenzen wenig auf Änderungen von [H⁺] bei Zugabe anderer Säuren oder Basen. Der pH- Wert einer Pufferlösung wird, wie schon gesagt, durch das Verhältnis

[schwache Säure] / [Salz]

oder [schwache Base ] / [Salz]

bestimmt. Je mehr sich das Verhältnis dem Wert 1 nähert, desto wirksamer können pH- Verschiebungen aufgefangen (abgepuffert) werden, desto größer ist die Pufferkapazität des Gemisches.

Zellen enthalten eine Vielzahl verschiedener Moleküle, viele davon sind Makromoleküle. Wie wir später in diesem Praktikum noch sehen werden, sind die Aktivitäten vieler dieser Moleküle stark pH- abhängig. Die meisten Moleküle sind gegenüber großen Änderungen des pH- Werts außerordentlich empfindlich. Um dem entgegenzuwirken, sind alle Lösungen in Organismen stark gepuffert (Zellinhalt, Blut ...etc.). Deswegen werden auch alle biochemischen, physiologischen und molekularbiologischen in vitro Experimente grundsätzlich unter Pufferzusatz durchgeführt .

Die Bedeutung der Pufferwirkung sollen Sie am ersten Praktikumsnachmittag durch Titrationsexperimente kennenlernen. Hierbei wird zu einer bestimmten Menge einer schwachen Säure (Base) schrittweise starke Base (Säure) hinzugegeben. Gemessen wird die Änderung des pH's als Funktion der Menge zugegebener Base (Säure). Selbstverständlich sind die Molaritäten der hierbei verwendeten Lösungen zu berücksichtigen Sie werden im Praktikum Wasser oder NaCl, Aminosäuren, eine Proteinlösung und Serum titrieren. Sie sollen die Titrationskurven untereinander vergleichen und die einzelnen Bereiche der Kurve deuten.

Es gibt 2 Möglichkeiten, pH- Werte zu messen:

1. Indikatoren : Es sind Substanzen von mehr oder weniger starkem saurem (oder basischem) Charakter, die in dissoziiertem und in undissoziiertem Zustand eine verschiedene Farbe aufweison. Der Umschlagspunkt entspricht dem pK- Wert. Es ist der pH- Wert, bei dem der Indikator zu 50% dissoziiert ist.

[Ion] / [Molekül] = 1

Ein solcher Punkt ist nicht immer einwandfrei feststellbar. In der Praxis hat man es mit einem Umschlagsbereich zu tun, die Genauigkeit der pH- Bestimmung hängt von der Art der resultierenden Mischfarbe ab. Je kleiner dieser Bereich ist, desto besser ist die betreffende Substanz als Indikator bei Titrationen brauchbar. Außerhalb des Umschlagsbereiches liegen alle Moleküle des Indikators vollständig entweder in dissoziierter oder in undissoziierter Form vor. Die Genauigkeit einer derartigen pH- Wert Bestimmung in biologischen Flüssigkeiten kann durch mehrere Fehlerquellen beeinträchtigt werden.

a) Salzfehler
b) Eiweißfehler
c) Gefärbte Lösungen

2 . pH- Meter (ein Voltmeter): Beim pH- Meter wird das Phänomen ausgenutzt, daß sich auf den beiden Seiten einer Glasmembran, die mit Lösungen verschiedener [H⁺] Konzentrationen (pH₁, pH₂) in Kontakt stehen, eine Potontialdifferenz delta E eingestellt:

delta E = - 2,303 RT / F (pH₂ - pH₁)

NERNSTsche Gleichung: s. auch Merbranpotential, Nervenzellen

Wenn pH₁ bekannt ist, läßt sich pH₂ aus delta E berechnen. Jedes pH- Meter muß vor Benutzung mit Standardpuffer geeicht werden (> Festlegung von pH₁. Ein pH- Meter - vor allem die Elektroden - sind Präzesionsgeräte, die einer besonderen Pfloge bedürfen.
Die "Elektrode" (Einstabmeßkette) darf niemals eintrocknen. Sie ist stets in Puffer oder einer 4 m KCl aufzuheben. Es ist darauf zu achten, daß das Innere mit 4 m KCl gefüllt ist. Die eigentliche Ableitung (im Inneren der Einstabmeßkette) geschieht durch Ag / AgCl₂ - Elektroden. Die Glasmembran ist gegen mechanische und chemische Schäde sehr empfindlich (also Vorsicht !). pH- Meter sind oberhalb pH 12 relativ ungenau (> Alkalifehler)

1. Harnstoff: (NH₂)₂CO: Durch Zugabe von Harnstoff können Wasserstoffbrücken gespalten werden

Wie erklären Sie sich das?

Als Folge davon werden Proteinmoleküle denaturiert, d.h. die Sekundär - und Tertiärstrukturon, die ja zumindest zu einem beträchtlichen Teil durch H - Brücken zusammengehalten werden, werden aufgelöst. Das Proteinmolekül liegt in einer Harnstofflösung in einer nicht - gefalteten Form vor.

2. Ammoniumsulfat (NH₄)₂SO₄ ist außerordontlich gut löslich, d h. die Ammoniumionen sind von einer starken Hydrathülle umgeben. Wasser ist knapp in einer konzentrierten (NH₄)₂ SO₄ - Lösung Das Ammoniumsulfat entzieht anderen, ebenfalls in der Lösung befindlichen Ionen das Hydratwasser. Man spricht hier von einem Aussalzeffekt.

Folge?
Ist der Entzug von Hydratwasser reversibel oder irreversibel?

3. Rinderblut. Das Blut stammt von frisch geschlachteten Rindern. Es ist am Morgen des Praktikumstagas vom Schlachthof geholt vorden (vor 7 Uhr). Eine, Ihnen wohl auch geläufige Erfahrung sagt, daß Blut verklumpt, wenn man es stehen läßt. Um das zu verhindern, gibt es 2 Möglichkeiten:

a) Zusätze zum Blut (z. B. Zitronensäure, oder Hirudin [eine Substanz aus Blutegeln] u.a.)
b) Defibrinisierung, d.h. man entfernt das Fibrin - ein Protein, welches für die Blutgerinnung erforderlich ist

Letzteres ist auch in unserem Falle getan worden. Unmittelbar nach dem Schlachten des Rindes wurde das Blut kräftig gerührt. Beim Rühren wird Luft untergemischt und das Fibrin verklumpt. Nach ca. 3 - 5 Min. Rühren ist das Blut voller zusammenhängender Klumpen, die leicht entfernt werden können. Das übrigbleibende Blut ist nunmehr weitgehend fibrinfrei und verklumpt nicht mehr. Derart behandeltes Blut erhalten Sie im Praktikum. Es ist natürlich nicht zu vermeiden, daß beim Verklumpen des Fibrins auch Blutkörperchen mit verklumpen und somit entfernt werden. Mit gerührtem Blut können daher z. B. die folgenden quantitativen Bestimmungen nicht mehr durchgeführt werden:

Bestimmung der Erythrozytenzahl.
der Leucozytenzahl.
des Hämoglobingohalts, u.a.

4. Hämin aus Rinderblut. Hämin ist der Porphyrinring des Hämoglobins im Blut. Als Zentralatom ist Fe ^II komplex gebundon. An diexes Eisen kann O₂ angelagert werden (Näheres s. 3.03). Hämoglobin enthält außer dem Hämin noch eine Eiweißkomponente, das Globin. Wir werden am 3. Praktikumsnachmittag die Bedeutung dleser beiden Komponenten für die O₂-Bindung kennenlernen. Dazu brauchen wir das reine Hämin- Präparat. Leider ist Hämin einer der wenigen Naturstoffe, die sich mit einem nur so minimalen Aufwand in reiner (kristalliner) Form gewinnen lassen. Die Kristalle - Sie werden sie sich unter dem Mikroskop ansehen können - haben eine klare rhombische Form. Nach ihrem Entdecker nennt man sie TEICHMANN'sche Kristalle.

Geben Sie zu je 1 ml Gelatinelösung (oder Eialbuminlösung) einige Tropfen von:

(NH₄)₂SO₄
Hg Cl₂
Aethanol
TCA

Bei welchem der Zusätze fällt Protein (Gelatine oder Eialbumin ) aus?
Ist das Präzipitat durch Zugabe von Wasser wieder in Lösung zu bringen?

Wiederholen Sie das Experiment. Versuchen Sie, das Präzipitat durch Zugabe von Harnstoft in Lösung zu bringen.

Die Versuchsanordnung besteht aus den folgenden Elementen:

Bürette (mit HCl oder NaOH)
Becherglas mit der Vorlage
Magnetkern
Magnetrührer
pH- Meter mit Elektrode
Hebebühne

	Füllen der Büretten: 1n Lösungen von NaOH und HCl stehen zur Verfügung, (rot markierte Bürette für Säure, blau markierte für Base verwenden).
	Vorlage: 150 ml (dafür das 250 ml Becherglas verwenden). Titrieren Sie hintereinander die folgenden Proben: a. H2O oder NaCl b. 2 der 3 Analysenproben ( A, B, oder C ) c. Eialbuminlösung oder Gelatinelösung d. Serum aus Rinderblut (Herstellung siehe. Punkt 6 )

Nachdem Sie das Becherglas mit einer der Vorlagen gefüllt haben, werfen Sie einen Magnetkern hinein und stellen die Probe auf den Magnetrührer. Achten Sie beim Anstellen des Magnetrührers darauf, daß der Magnetkern im Zentrum des Becherglases rotiert und keine exzentrischen Bewegungen oder gar Sprünge durchführt. Regeln Sie die Geschwindigkeit so ein, daß ein ruhiger Lauf zustande kommt.

Achtung: der Magnetrührer ist auch als Heizplatte verwendbar. Bei den Titrationsversuchen darf die Heizung nicht eingeschaltet werden. Auf Kontrollampen achten.

Erst nachdem ein ruhiger Lauf des Magnetkerns sichergestellt ist, darf die Elektrode des pH-Meters in die Vorlage eingetaucht werden. Die Elektrode soll mindestons ca. 3 cm in die Flüssigkeit eintauchen. Das Gerät ist unmittelbar vor Praktikumsbeginn geeicht worden. Achten Sie darauf, daß a. die Elektrode stets feucht bleibt. Bei Nichtbenutzung in die bereitstehende Pufferlösung tauchen b. Bevor Sie die Elektrode in eine neue Lösung tauchen, spritzen Sie sie mit Aqua dest ab, und wischen Sie die Spitze vorsichtig mit einem Kleenex - Tuch ab.

Bitte Notsstecker nicht ziehen ! (andernfalls Neueichung erfordorlich !)

	pH- Wert der Vorlage ablesen Achtung: die pH- Meter, die wir Ihnen zur Verfügung stellen sind leider recht reaktionsträge. Es dauert daher jeweils einige Zeit (ca. 30 sec.), bevor Sie den Meßwert ablesen können.
	Beginn dor eigentlichen Titration. a. Beginnen Sie die Tiltration mit NaOH. Geben Sie die Base in 0,5 ml Schritten hinzu. Lesen Sie nach jeder Zugabe den pH- Wert ab. Brechen Sie die Titration ab, sobald der pH 12,0 erreicht ist. b. Titrieren Sie mit HCl zurück (ebenfalls in 0,5 ml Schritten). Ende bei pH 2,0
	Titration von Rinderserum. Abzentrifugieren der Erythrozyten. 10 min bei maximaler Drehzahl. Vorsicht beim Abpipettieren des Serums (Pasteurpipette verwenden !). Erythrozyten wirbeln sehr leicht auf. Gegebenenfalls müssen Sie Ihre Serumpräparation noch ein zweites Mal zentrifugieren. Die Lösung muß absolut klar aussehen !

Problem Zeiteinteilung: Denken Sie rechtzeitig daran, mit dem Zentrifugieren zu beglnnen. Planen Sie ruhig 1 Stunde für die Serumproduktion ein. Wenn Sie etwas Serum übrig haben, prüfen Sie zum Praktitumsende, ob es sinnvoll ist, eine Titration von gekochtem Serum durchzuführen.

Graphische Darstellung (Millimeterpapier) pH gegen Verbrauch von Base (Säure). Einigen Sie sich mit Ihrer Nachbargruppe auf einen einheitlichen Darstellungstaßstab, damit Sie die Titrationskurven direkt miteinander vergleichen können. Sie sollen durch einen derartigen Vergleich feststellen

a. Welche der Analysenproben A, B oder C ist

Glycin
Arginin
Glutaminsäure ?

Begründen Sie Ihre Entscheidungen !

b. Wo liegen die pK- Werte der analysierten Aminosäuren?

Deuten Sie die unterschiedlichen Steigungen der Titrationskurven in den verschiedenen pH- Bereichen. In welchen pH- Bereichen eignet sich eine Aminosäure als Puffersubstanz?

c. Vergleichen Sie die Titrationskurve einer Aminosäure mit der des H₂O - oder der NaCl-Lösung (0,9%ig) und der eines Proteins. Gibt es prinzipielle Unterschiede zwischen der Titrationskurve eines Proteins und der eines seiner Bausteine (> einer Aminosäure)?

Übrigens: das Molekulargewicht von Gelatine liegt bei < 345.000 und das von Eialbumin bei 65.000

d. Vergleich der Titrationskurve von Rinderserum mit der der Proteine und Aminosäuren.

Worauf beruht die Pufferwirkung des Serums?

Reichen Ihre Daten, um diese Frage zu entscheiden ?

Vorschrift abgeändert nach GATTERMANN - WIELAND: Praxis des organischen Chemikers.
Nach Abschluß der Titrationen können Sie den Magnetrührer als Heizplatte einsetzen (Versuch am Rande: Kochen Sie Rinderserum im Wasserbad auf, anschließend wlssen Sie, warum wir auf die Titration von gekochtem Serum verzichten).
Hämindarstellung: (Schutzbrille tragen !)

1. Erhitzen Sie im 300 ml Erlenmeyer 100 ml Eisessig auf 100°C. (Siedepunkt von Eisessig: 118,5°C) Zusatz: 0,2 ml der konz. NaCl.

2. Sobald 100°C erreicht sind, schalten Sie die Heizung ab, achten Sie aber bitte darauf, daß Ihre Lösung nicht auf weniger als 80°C abkühlt.

3. Geben Sie mit Hilfe einer Pasteurpipette tropfenweise 20 ml Blut hinzu (Rühren mit Magnet). Veränderungen des Reaktionsgemisches protokollieren. Achten Sie beim Zugeben des Bluts darauf, daß keine Blutstropfen am Glasrand hängenbleiben (Folge: denaturiertes Protein - und damit möchten Sie Ihre Kristallpräparation sicher nicht vorunreinigen)

4. Nutschen Sie das auf etwa 50°C abgekühlte Reaktionsgemisch ab (Vorsicht: das Filter verstopft sehr leicht). Verzichten Sie darauf, Ihre Probe quantitativ weiterzuverarbeiten, brechen Sie die Filtration ab, sobald das Filter zugesetzt ist (wenn Sie Zeit haben, können Sie einen zweiten Filtrationsansatz mit einem neuen Filter starten).

5. Waschen Sie die Rückstände auf dem Filter mit Alkohol

6. Trocknen lassen

Übertragen Sie die Kristalle mit dem Metallspatel in das Probegläschen (Sie brauchen sie in 14 Tagen).